蘆筍全雄試管苗的繁育技術

朱紅林， 徐 靖， 陳健曉， 王效寧

(海南省農業科學院 糧食作物研究所， 農業部作物基因資源與種質創制海南科學觀測試驗站， 海南省農作物遺傳育種重點實驗室， 海南 ?？?571100)

蘆筍全雄試管苗的繁育技術

朱紅林， 徐 靖， 陳健曉， 王效寧*

(海南省農業科學院 糧食作物研究所， 農業部作物基因資源與種質創制海南科學觀測試驗站， 海南省農作物遺傳育種重點實驗室， 海南 海口 571100)

為給蘆筍全雄試管苗的規?；a提供可靠的技術途徑，以大田蘆筍莖段為外植體，采用組織培養的方法，研究建立蘆筍全雄試管苗繁育技術。結果表明：0.1%升汞溶液消毒8 min最佳，外植體污染率為0，成活率達100%；以MS為基本培養基，6-BA濃度為0.4 mg/L時，外植體芽誘導率最高，達100%；6-BA和NAA配合使用，繼代增殖最佳，繁殖周期為30 d，增殖系數為5.88；以1/2MS為基本培養基，添加1.0 mg/L IBA、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L PP333和15 mg/L Spm時，生根率為86.67%，根多、長、粗壯，且有須根，利于煉苗移栽成活。

蘆筍； 全雄； 試管苗； 繁育技術

蘆筍(Asparagusofficinalis)屬百合科天門冬屬多年生草本宿根植物，又稱石刁柏、龍須菜，是一種低熱量高營養的保健蔬菜，被譽為世界十大名菜之一，享有蔬菜之王的美稱，同時其又對高血壓、心臟病、癌癥有特殊的療效[1-2]。由于其食用和藥用價值俱佳，在歐美各國、日本、東南亞等國際市場中已成為不可替代的高級營養蔬菜和保健食品，市場需求日益增加，供不應求[3]。蘆筍雌雄異株，在一般情況下(常規種大田內)，雌雄株各占1/2，而雄株產量一般比雌株產量高20%～30%，但蘆筍種子生產困難，成本高，蘆筍種苗的缺乏限制我國蘆筍產業的發展[4]。近年來，國內外學者在蘆筍組織培養方面進行了諸多研究，并取得了較大發展，但蘆筍組培試管苗生根難、生根率不穩定和移栽成活率低仍是蘆筍試管苗實現產業化生產的制約因素[5-7]，仍需進一步研究。因此，筆者擬在前人研究的基礎上，通過生根培養基中加入多效唑(PP333)和精胺(Spm)，探索建立高效的蘆筍全雄試管苗高效快繁技術，以期解決蘆筍優質種苗缺乏問題，為蘆筍產業發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

20株格雷斯綠蘆筍雄株由東方光華現代農業開發有限公司提供。

1.2 外植體消毒及接種

于晴天午后，選取20～25 cm莖，取其頂上約15 cm段。在超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，選用1%NaClO溶液振蕩浸泡消毒時間設為10 min、13 min、15 min和17 min 4個處理；用0.1% HgCl2溶液振蕩浸泡消毒，時間設為6 min、8 min、10 min和12 min 4個處理，無菌水沖洗5遍。將消毒的外植體切成約1.5～2.0 cm長的單節莖段，接種到誘導培養基中(圖示A)，15 d后，統計污染率和存活率。

污染率=(污染外植體數/接種外植體總數)×100%。

存活率=(存活的外植體數/接種的外植體總數)×100%

1.3 培養條件的設計

1.3.1 誘導培養 以MS為基本培養基，分別添加6-BA 0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L和1.5 mg/L 5個濃度水平，每瓶接種4 個外植體，每處理接種10瓶。接種30 d后統計莖段芽誘導率，其間觀察誘導出芽的生長狀況(圖示B)。

1.3.2 繼代增殖培養 經誘導長出的嫩莖新梢切成單節莖段，接種到以MS為基本培養基、分別添加不同濃度6-BA(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.6 mg/L)和NAA(0、0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L)的培養基中，共16個處理，每個處理5瓶，每瓶5個單節莖段，培養30 d后記錄生長情況，并統計誘導產生叢生芽數，計算繁殖系數(圖示C)。

1.3.3 生根培養 切取增殖培養所得芽頂部長約1 cm(圖示D)，轉接到生根培養基上。生根培養基的確定分兩步：第一步，以1/2MS為基本培養基，設計3因素4水平的正交試驗：IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5mg/L和2.0 mg/L)、KT(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L)、PP333(0、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)，共16個處理，每個處理15瓶，每瓶3株，觀察記錄根生長情況，30 d后統計生根率，確定IBA、KT、PP333的最佳組合濃度；第二步，第一步中確定的最佳組合濃度培養基中分別添加Spm 0、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L和20 mg/L 5個濃度水平，每個處理15瓶，每瓶3株，觀察記錄開始生根天數及根生長情況，30 d后統計生根率(圖示E)。

1.3.4 共同培養條件 誘導培養和增殖培養基中添加白砂糖30 g/L，生根培養基中加白砂糖20 g/L，卡拉膠均為6.0 g/L，培養基pH 5.8。培養溫度(28±1)℃，光照10 h/d，光照強度為2 000 lx以上。

注：A為外植體，B為外植體誘導出芽，C為莖段增值叢生芽，D為生根培養，E為組培苗生根。

Note: A, explants; B, buds induced from explants; C, multiple shoot from stem segments; D, rooting culture; E, rooting of tissue culture seedling.

圖示 筍全雄試管苗繁育植株形態

Fig. Plant morphology bred by all-male tube seedlings ofA.officinalis

1.4 數據處理

用Excel 2007 數據分析庫進行數據統計、方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑各消毒時間對蘆薈全雄試管苗的消毒效果

不同的消毒劑和消毒時間對外植體消毒效果有較大的差別，同一種消毒劑，隨著消毒時間的延長污染率降低，但對外植體的損傷越大(表1)。短時間內，0.1%HgCl2溶液的消毒效果比1%NaCIO溶液的消毒效果好。但0.1%HgCl2溶液對幼嫩莖段的損傷較大，莖尖長約3 cm的幼嫩莖段在用0.1%HgCl2溶液消毒8 min時，存活率≤20%。減少0.1%HgCl2溶液的消毒時間至6 min，莖尖和莖段出現嚴重污染。綜合考慮污染率和存活率，外植體的最佳取材為莖尖3 cm以下長約12 cm的莖段，最佳消毒方案為0.1%HgCl2溶液消毒8 min，存活率達100%。

2.2 不同濃度6-BA 處理蘆筍全雄試管苗的芽生長情況

從表2看出，接種培養7 d后，外植體在誘導培養基上直接從莖節處分化出芽點。6-BA 對蘆筍莖段芽誘導影響較大，當培養基中不加6-BA時，芽誘導率僅為7.5%；而當6-BA濃度為0.4 mg/L時，外植體100%誘導出芽，芽生長快而粗壯；6-BA濃度繼續升高，芽誘導率反而下降，出現黃化、玻璃花芽；當6-BA濃度達1.5 mg/L時，只有愈傷組織，不分化芽。

表1 不同消毒劑各消毒時間對蘆筍全雄試管苗的消毒效果

表2 不同濃度6-BA 處理蘆筍全雄試管苗芽的生長情況

2.3 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗根與芽的增殖

2.3.1 根誘導 由表3數據經方差分析，IBA、KT和PP3333個因子對蘆筍莖尖根誘導的影響均達顯著水平，其中IBA影響作用大于KT和PP333，三者的相互作用對根誘導的影響顯著，適宜的配比，根誘導的效果最好。經多重比較，IBA 1.0 mg/L與0.5 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L差異顯著，當IBA濃度為1.0 mg/L 時，NAA 0.1 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差異也達顯著水平，當IBA濃度為1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L時，PP3331.0 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L的差異也達顯著水平。IBA1.0 mg/L與NAA 0.10 mg/L、PP3331.0 mg/L三者配合，根誘導率最大，根系生長狀況也最好。

表3 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗根的分化情況

注:同列中不同字母表示差異達顯著水平(P<0.05)(下同)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated 5% significant level. The same below.

2.3.2 牙增殖 從表4可看出，單節莖段在16種激素組合處理中的增殖系數差異顯著，最高達5.88，最低只有0.2。6-BA濃度低于或高于0.4 mg/L時，叢生芽增殖系數都較低，差異顯著。說明，較低和較高濃度的6-BA對叢生芽的增殖效果均不理想。經對各處理的增殖系數進行方差分析，6-BA和NAA對叢生芽增殖的影響均達顯著差異水平，其中6-BA對叢生芽的誘導影響作用大于NAA；6-BA和NAA的相互作用對叢生芽增殖的影響達顯著差異水平，兩者適宜的配比，叢生芽的增殖效果最好。經多重比較，6-BA 0.4 mg/L與0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.6 mg/L差異顯著，當6-BA濃度為0.4 mg/L 時，NAA 0.1 mg/L與0、0.05 mg/L、0.20 mg/L的差異也達顯著水平，6-BA 0.4 mg/L與NAA 0.10 mg/L兩者配合，叢生芽的增殖系數最大，生長狀況也最好。

表4 不同激素組合處理蘆筍全雄試管苗的芽增殖情況

2.4 不同濃度精胺(Spm)處理蘆筍全雄試管苗的根生長情況

從表5可看出，在5種不同處理中，試管苗在株高上無顯著性差異，根誘導率、根數量、根長度和根平均直徑均存在差異顯著。隨著Spm濃度的升高，根誘導率呈先上升后下降趨勢，Spm濃度為15 mg/L時，根誘導率最高，達80.67%。同時，根數量最多、最長、最粗壯，且有須根，根質最佳，利于煉苗移栽。

表5 不同Spm 濃度處理蘆筍全雄試管苗的根分化情況

3 結論與討論

1) 建立了蘆筍全雄試管苗高效繁育技術。于晴天午后，剪取雄蘆筍植株莖段作外植體，用0.1%升汞溶液消毒8 min，接種于培養基MS+ 6-BA0.4 mg/L +白糖30 g/L +卡拉膠6.0 g/L(pH 5.8)中誘導，再將誘導的芽切割成單節莖段置于培養基MS+6-BA 0.4 mg/L +NAA 0.1 mg/L +30 g/L白糖+6.0 g/L卡拉膠(pH 5.8)中繼代增殖，30 d后，切取增殖培養所得芽頂部約1 cm長，轉接到生根培養基1/2MS+IBA1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L + PP3331.0 mg/L + Spm 15 mg/L+白糖20 g/L +卡拉膠6.0 g/L(pH=5.8)中(其余莖段置于增殖培養基培養)。外植體芽誘導率為100%，繼代增殖繁殖周期為30 d，增殖系數平均5.88，生根率86.67%。

2) 多效唑(PP333)是一種植物生長延緩劑，能控長矮化，提高葉綠素含量，增強植物抗逆性。PP333主要是通過阻礙貝殼杉烯向異貝殼杉烯酸的氧化，抑制赤霉素的生物合成發揮生理效應[8]。在植物組織培養中，適當濃度的多效唑均有利于植物愈傷組織的誘導、芽增殖、壯苗和生根等方面[9]。本研究結果顯示，1.0 mg/L PP333有利于提高蘆筍組培苗的生根率，改善根質，并促使壯苗。

精胺(spermine, Spm )是一種普遍存在于植物體內，對植物生長發育有廣泛影響的多胺類化合物，許多研究表明，精胺對促進植物細胞分化、加速莖(芽)和根的生長有重要作用[10]。楊洪強等[11]研究證實，外源Spm可增加蘋果幼苗新根數量；Hummel等[12]研究發現，甘藍根系中內源Spm含量在0.1 μmol/L時，對根的長度影響最大；鄒英寧等[13]研究發現，Spm濃度為1 mmol/L時有利于金柑組培苗植株生長和根系生長。本研究結果表明，生根培養基中加入15 mg/L Spm，可促進蘆筍組培苗發根早、根多粗壯，且有須根，利于煉苗移栽。Spm促進植株生長和根系的形態可能與其提高植物組織內碳水化合物的含量關系密切，但其關系還有待進一步深入研究。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Propagation Technique of All-male Tissue Culture ofAsparagusofficinalis

ZHU Honglin, XU Jing, CHEN Jianxiao, WANG Xiaoning*

(CerealCropResearchInstitute,HainanAcademyofAgriculturalSciences/ScientificObservationstationofHainanforCropGeneResourcesandGermplasmInnovation,MinistryofAgriculture,Haikou,Hainan571100,China)

To offer a credible way for seedling mass production of all-maleA.officinalis, stem segments from fieldA.officinaliswere cultured to establish a rapid propagation technique system. Results:0.1% HgCl2solution for eight minutes made a good effect, the contamination rate was 0, the survival rate was 100%; When the 6-BA concentration was 0.4 mg/L, in the MS basic culture medium, the rate of bud induction was the highest, 100%; 6-BA combined with NAA made a good subculture multiplication, the reproductive cycle was 30 days, and the proliferation coefficient was 5.88. When 1.0 mg/L IBA, 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L PP333and 15 mg/L Spm were added to the 1/2MS basic culture medium, the rooting rate was 86.67%, and roots were the longest and thickest with fibrous roots, which was suitable for transplanting of plantlets.

Asparagusofficinalis; all-male; tube seedling; propagation technique

2015-08-31； 2016-03-27修回

海南省自然科學基金項目“蘆筍全雄試管苗高效繁育技術研究”(314153)

朱紅林(1973-)，女，助理研究員，碩士，從事植物組織培養研究。E-mail:714420368@qq.com

*通訊作者：王效寧(1973-)，男，研究員，碩士，從事作物遺傳育種研究。E-mail:13368939015@163.com

1001-3601(2016)04-0151-0024-04

S644.6

A