生物降解菌MZS1對大芥菜及土壤中毒死蜱的降解效果

黃春萍， 李 江， 李艷琳， 伍君華， 王 靜， 李 琪

(1.四川師范大學 生命科學學院， 四川 成都 610068； 2.農田生態服務能力建設四川省高校工程中心， 四川 成都 610068； 3.四川省農業科學院 農產品加工研究所， 四川 成都 610066)

生物降解菌MZS1對大芥菜及土壤中毒死蜱的降解效果

黃春萍1,2， 李 江1， 李艷琳3， 伍君華1， 王 靜1， 李 琪1,2

(1.四川師范大學 生命科學學院， 四川 成都 610068； 2.農田生態服務能力建設四川省高校工程中心， 四川 成都 610068； 3.四川省農業科學院 農產品加工研究所， 四川 成都 610066)

為探明生物降解菌對有機磷類農藥殘留的降解效果，豐富毒死蜱殘留的生物降解菌菌種資源，采用傳統方法和分子鑒定方法對實驗室分離獲得的毒死蜱降解菌株進行鑒定，并采用室內模擬與田間試驗相結合的方法研究該菌株對大芥菜及土壤中毒死蜱殘留的生物修復作用。結果表明：該菌株為枯草芽孢桿菌MZS1(BacillussubtilisMZS1)。室內，施用菌株MZS1處理15 d后其對土壤中濃度為5 mg/kg和10 mg/kg毒死蜱的降解率分別為49.64%和53.02%；田間，隨含菌量的增加，菌株MZS1對大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率增加，其中，施用量為5 L/hm2時，15 d后其對大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率分別為33.27%和42.93%。菌株MZS1對大芥菜的生長具有一定的促進作用。

芽孢桿菌； 毒死蜱； 降解； 生物修復； 大芥菜; 土壤

毒死蜱(Chlorpyrifos, CP) 化學名稱為O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，商品名樂斯本、白蟻清等[1]，可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，殺滅害蟲，且高效低毒，因此，作為替代高毒有機磷類農藥的主要品種在世界范圍內廣泛應用[2]。但隨著毒死蜱用量的不斷增加，其對環境產生的污染問題日益突出，全球已有大范圍的水生和陸生生態系統檢測到毒死蜱殘留[3-5]。毒死蜱在植株葉片上的殘留期短，但在土壤中可長期殘留，并具有生物富集作用[6-7]。毒死蜱對人體的毒性中等，低劑量(μg/L～ng/L級)毒死蜱即可干擾人類的內分泌，特別是對兒童和孕婦具有嚴重危害[4-5]。

以生物修復為理論基礎的農藥殘留微生物降解技術具有高效、環保的特點，是目前降低農產品和農業生產環境中農藥殘留的重要方法[8-9]。一些微生物在特定環境條件下可以毒死蜱作為自身代謝的底物，經過新陳代謝將其從環境中去除。因此，人們不斷地馴化、篩選能夠同時降解毒死蜱及其水解產物TCP 的微生物[9-13]，但目前的研究大部分還處于實驗室階段，將農藥降解菌用于生產實踐的研究還很少[6, 10]；已獲得的很多微生物有些對毒死蜱的降解特異性和降解效率不高，或其降解毒死蜱的酶類熱穩定性不高[11-13]；對生產應用中微生物降解的認知很少[14-15]。土壤條件和天氣變化等引起環境條件不穩定，pH、溫度和濕度等因素波動較大，均影響耕作類植物中農藥的殘余量，也可對農藥降解菌的生長產生影響。

降解農藥殘留的多功能微生物將成為可持續發展農業和生態農業發展的戰略需求[16-17]。繼續篩選、分離和純化高效降解毒死蜱的菌株，擴大其菌種資源，研究菌株在大田條件下對該農藥殘留的生物修復作用，對促進生物制劑降解農藥殘留的研發與應用具有重要意義。為此，筆者于2014年冬季在前期研究基礎上，采用室內模擬與田間試驗相結合的方法，研究菌株MZS1對大芥菜和土壤中毒死蜱污染的生物修復作用，以期探明其對有機磷類農藥殘留的降解效果，豐富毒死蜱殘留的生物降解菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株MZS1：從四川省理縣畢棚溝(102°53′～102°57′E，31°14′～31°19′N，海拔2 458～4 619 m)典型岷江冷杉(Abiesfaxoniana)原始林凋落物中分離篩選到的1株高效降解木質素、纖維素的微生物，該菌株對岷江冷杉凋落物中的木質素和纖維素具有高效的降解作用。

大芥菜：為四川省農業科學院新都實驗基地常年種植的大芥菜(Brassicajuncea)。

土壤：種植土壤為紫色土，弱酸性(pH 6.5～6.6)，有機質含量約13.2 g/kg。

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.4，121℃滅菌20 min。固體培養基為加入18～20 g/L瓊脂粉的LB培養基。

試劑：15%甲維毒死蜱乳油，山東樂邦化學品有限公司；98.0%毒死蜱標準品，北京壇墨質檢科技有限公司。

試驗儀器：離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA純化回收試劑盒(天根，北京); PCR 擴增儀(Bio-rad，美國)；熒光-光學顯微鏡(萊卡，日本)；DIONEX高效液相色譜(戴安，美國)；755B分光光度計(島津，日本)。

1.2 菌株的鑒定

參照文獻[18]的方法，對菌株MZS1進行革蘭氏染色、芽孢染色及鞭毛染色等常規形態學觀察；并依據《常見細菌系統鑒定手冊》進行菌株的生理生化試驗鑒定[18]。參照文獻[19]的方法，設計正向引物P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGGCTT AGA ACG AAC GCT-3′，反向引物P6：5′-TAC GGC TAC CTT GTTACG ACT TCA CCC C-3′。PCR反應體系(50 μL)為：10×PCR Buffer 3 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；P1引物0.8 μL；P6引物0.8 μL；Taq酶1.5 μL；模板2 μL；水38.9 μL。PCR 的反應條件為94℃預變性3 min，然后94℃變性0.5 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，總共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。得到的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶回收后由上海生工生物工程有限公司進行序列測定。測序得到的核苷酸序列，通過NCBI的Blast軟件與目前報道的16S rDNA序列進行比較。

1.3 目標菌株對毒死蜱的降解作用

1.3.1 毒死蜱含量檢測 參照文獻[20]的方法，采用高效液相色譜法檢測樣品中毒死蜱的含量。色譜條件：色譜柱為waters 515 HPLC Pump，waters 2487檢測器，Model 100柱溫箱，固定相為Alltech Apollo C18 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇∶水=85∶15 (V∶V)，流速1 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為230 nm，進樣量為 10 μL。

1.3.2 室內模擬試驗 采用室內模擬試驗研究菌株MZS1對受毒死蜱污染土壤的降解效果。稱取100 g無毒死蜱污染的土壤，風干，置于250 mL三角燒瓶中，添加一定量的超純水，使得土壤含水量為10%，滅菌。參考毒死蜱在農田的實際使用量，采用5 mg/kg和10 mg/kg分別進行毒死蜱的外源添加，各制備30瓶備用。活化菌株MZS1在LB培養基中 37℃培養16～18 h，然后每瓶土壤添加10 mL 菌液，混勻，以加10 mL無菌水作為對照。三角燒瓶置于37℃恒溫培養箱中避光培養，分別于培養5 d、10 d和15 d后取外源添加毒死蜱不同濃度土壤樣品各5瓶，然后按1.3.1采用高效液相色譜法測定其毒死蜱含量。

1.3.3 田間試驗 于2014年11月初至2015年2月初在四川省農業科學院新都實驗基地進行，試驗地常年種植大芥菜。在試驗田內隨機選取3塊相同的區域(25 m× 25 m)作為重復試驗樣地。于大芥菜移栽并定植40 d后噴施甲維毒死蜱乳油(有效成分)60 g/hm2，2 d后噴施MZS1菌液，不同處理的菌液量分別為1 L/hm2、2.5 L/hm2和5 L/hm2，以5 L滅菌培養基作為空白對照，對水至總體積50 L/hm2進行噴施。噴施菌液5 d、10 d和15 d后，分別在3個重復試驗樣地內隨機取植株樣品各5株，并采用5點取樣法分別采集土壤樣品各500 g，然后按1.3.1采用高效液相色譜法檢測毒死蜱的含量。并于采收日在每個處理地內分別隨機采收25株成熟的大芥菜測定其地上生物量。試驗期間的措施按日常管理進行。

1.4 數據統計與分析

所有數據采用Spss 16.0軟件進行分析。參照文獻[21]的方法計算毒死蜱降解率。

毒死蜱降解率=(1-ρi/ρ0)×100%

式中：ρi為處理后殘留毒死蜱含量(mg/kg)，ρ0為對照處理殘留毒死蜱含量(mg/kg)。

2 結果與分析

2.1 菌株MZS1 的鑒定

菌株MZS1在含100 mg/L毒死蜱的LB固體培養基上生長良好，其革蘭氏染色反應呈陽性。從圖1可見，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，長1.5～2.25 μm，寬0.5～0.75 μm；具有芽孢形態，芽孢橢圓形、中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大，鞭毛周生；生長在葡萄糖營養瓊脂上的幼齡細胞用呂氏美藍染色呈淡染色，原生質內無不著色顆粒；相差顯微鏡上觀察到菌體翻轉運動。菌株MZS1在LB固體培養基上生長的菌落呈不規則狀，干燥、灰白色、不透明、稍突起、有皺折、邊緣不整齊隆起，菌落與培養基緊貼，不易挑取，挑入水中時保持膜狀；在牛肉膏蛋白胨液體培養基中旺盛生長，液體渾濁，無沉淀，靜止培養則在液體表面形成較光滑的一層薄膜，表面有顆粒，振蕩時菌膜成團沉底。由此特征判斷，MZS1屬于芽孢桿菌屬的群1[22-23]。因此，以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為對照，對菌株MZS1進行生理生化檢測(表)，結合查詢芽孢桿菌分類檢索表[22-23]，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌MZS1(B.subtilisMZS1)。將其16S rDNA測序獲得的序列與GenBank數據庫中已收錄的16S rDNA序列進行同源性比較分析，該菌株16S rDNA序列 (Genbank 中的登錄號為：KJ882376) 與B.subtilis具有99%的同源性；結合該菌株的形態和生理學特性，最終確定該菌株為枯草芽孢桿菌MZS1。

圖1 菌株MZS1 芽孢、菌體及鞭毛的形態特征

Fig.1 Morphological characteristics of spore, thallus and flagellum of MZS1 strain

表 菌株MZS1 與枯草芽孢桿菌的生理生化特征比較

注：+表示陽性反應；-表示陰性反應。

Note: + and - indicates positive and negative reaction separately.

2.2 菌株MZS1 對土壤和大芥菜中毒死蜱的降解作用

2.2.1 室內模擬試驗 從圖2可見，隨時間的增加，菌株MZS1對土壤中毒死蜱的降解率呈上升趨勢。培養15 d時，其對濃度為5 mg/kg和10 mg/kg毒死蜱的降解率分別為49.64%和53.02%。由于模擬試驗避光進行，噴施無菌水的對照土壤中毒死蜱未降解。說明，菌株MZS1對毒死蜱進行了有效的降解。對毒死蜱降解率與取樣時間之間各項數據的差異顯著性分析表明：初始濃度為5 mg/kg時，不同時間毒死蜱的降解率均存在顯著差異(P<0.05)；而初始濃度為10 mg/kg時，毒死蜱第5 天時的降解率與第10 天和第15天時均存在顯著差異(P<0.05)，但第10天與第15天時的降解率之間無顯著差異。

圖2 菌株MZS1 對模擬土壤毒死蜱的降解率

Fig.2 Degradation rate of chlorpyrifos in the simulated soil by applying MZS1 strain

圖3 菌株MZS1 對土壤和大芥菜毒死蜱的降解率

Fig.3 Degradation rate of chlorpyrifos in soil andB.junceaby applying MZS1 strain

2.2.2 田間試驗 從圖3可見：隨MZS1菌液處理濃度增加，其對大芥菜及土壤中毒死蜱的降解率呈增加趨勢；同時，隨處理時間的增加，不同濃度菌液處理大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率也呈增加趨勢。經方差分析表明：相同時間，不同濃度處理之間，大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率均存在顯著性差異(P<0.05)。而不同時間同一濃度的MZS1菌液處理，大芥菜毒死蜱降解率均無顯著性差異；同時，土壤中毒死蜱降解率也幾乎無顯著性差異，僅分別以2.5 L/hm2和5 L/hm2MZS1菌液處理條件下，10 d與15 d的降解率存在顯著性差異(P<0.05)。其中，菌液施用量為5 L/hm2時，15 d后對大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率最高，分別為33.27%和42.93%。

2.3 菌株MZS1 對大芥菜生物量的影響

經測定，空白對照(滅菌培養基)處理大芥菜地上部的生物量(平均，下同)為(2.91±0.26)kg/株，噴施菌液量為1 L/hm2、2.5 L/hm2和5 L/hm2的大芥菜地上部的生物量分別為(3.11±0.35)kg/株、(3.33±0.36)kg/株和(3.52±0.35)kg/株。經方差分析表明：MZS1菌液不同處理濃度大芥菜的地上生物量與對照之間差異顯著(P<0.05)，1 L/hm2和5 L/hm2處理的大芥菜地上生物量也存在顯著性差異(P<0.05)。說明，MZS1菌液對大芥菜生長有促進作用。

3 結論與討論

研究結果表明，從川西高寒岷江冷杉原始林凋落物中分離篩選到的菌株MZS1為枯草芽孢桿菌MZS1 (B.subtilisMZS1)，其能有效降解大芥菜和土壤中的毒死蜱，促進大芥菜的生長，提高其地上生物量，具有開發優良生物肥料的潛在價值。室內培養15 d時，菌株MZS1對5 mg/kg和10 mg/kg土壤中毒死蜱的降解率分別為49.64%和53.02%；MZS1菌液田間施用量為5 L/hm2時，大芥菜平均株重最高，為(3.52±0.35)kg/株，且施用15 d后其對大芥菜和土壤中毒死蜱的降解率最高，分別為33.27%和42.93%。

與室內模擬試驗結果相比，田間施用菌株MZS1對大芥菜及其種植土壤中毒死蜱的降解效率有所降低，可能是由于菌株的生長和毒死蜱本身受到大田不穩定環境因子的影響所致[24]。菌株對大芥菜毒死蜱的降解率較對土壤中毒死蜱的降解率低，可能是由于菌株在土壤中的生長能力較高，并受到土壤中較復雜環境和生物因素的影響所致[25]。由于菌株MZS1來源于高寒地帶，對冬天較冷的溫度能更好地適應，因此，非常適于冬季種植作物的毒死蜱殘留治理。

有研究認為，施用高含量的菌劑可提高對菊酯類農藥的降解效率，但對作物生長具有一定的抑制作用[24]。而該研究結果表明，芽孢桿菌MZS1不僅對大芥菜及其土壤中的毒死蜱具有較好的降解作用，而且對大芥菜的生長具有一定的促進作用。因此，進一步弄清枯草芽孢桿菌MZS1的生物功能是今后研究的重點。

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(責任編輯： 王 海)

Effect of ApplyingBacillussubtilisMZS1 Strain on Degradation of Chlorpyrifos Residue inBrassicajunceaand Soil

HUANG Chunping1, 2, LI Jiang1, LI Yanlin3, WU Junhua1, WANG Jing1, LI Qi1, 2

(1.CollegeofLifeSciences,SichuanNormalUniversity,Chengdu,Sichuan610068; 2.SichuanEngineeringCenterforFarmlandEcosystemServiceCapacityConstruction,Chengdu,Sichuan610068; 3.InstituteofAgro-productsProcessing,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu,Sichuan610066,China)

The degradation strain against Chlorpyrifos was isolated and identified by the traditional and molecular identification methods and the bioremediation effect of the strain on chlorpyrifos residue inB.junceaand soil was studied by indoor simulation and field tests to explore the degradation efficiency of biodegradable bacteria against the residue of organophosphorus pesticides and enrich biodegradable bacteria resources against Chlorpyrifos residue. Results: The strain isB.subtilisMZS1. The degradation rate of chlorpyrifos in soils applying with 5 mg/kg and 10 mg/kg MZS1 is 49.64% and 53.02% after 15 d in the indoor simulation test respectively. The degradation rate of chlorpyrifos inB.junceaand soil increases with increase of MZS1 application amount in the field test and the degradation rate of chlorpyrifos inB.junceaand soil is 33.27% and 42.93% after 15 d separately when MZS1 application amount is 5 L/hm2. The MZS1 strain has a certain promotion effect on growth ofB.juncea.

Bacillus; chlorpyrifos; degradation; bioremediation;Braddicajuncea; soil

2015-07-23； 2016-04-08修回

四川省高等學校工程中心開放課題基金項目“農田生態服務能力建設”(2014-GCZH-03)；四川省教育廳課題“高山森林溪流中的微生物群落變化”(15ZB0031)；四川師范大學開放項目“毒死蜱降解微生物的篩選及應用”(KF2015017)；四川師范大學大精開放基金項目(DJ2015-1, DJ2015-14)

黃春萍(1980-)，女，高級實驗師，在讀博士，從事環境微生物、微生物生態學研究工作。E-mail:13402856345@139.com

1001-3601(2016)04-0162-0066-05

S182

A