基于EST-SSR標記的藍莓品種指紋圖譜構建及遺傳多樣性

高雄梅， 徐國輝， 王賀新， 侯義龍

(1.大連大學 生命科學與技術學院， 遼寧 大連 116622； 2.大連大學 現代農業研究院， 遼寧 大連 116622)

基于EST-SSR標記的藍莓品種指紋圖譜構建及遺傳多樣性

高雄梅1， 徐國輝2*， 王賀新2， 侯義龍1

(1.大連大學 生命科學與技術學院， 遼寧 大連 116622； 2.大連大學 現代農業研究院， 遼寧 大連 116622)

為給藍莓品種鑒別、優良雜交組合選配提供分子水平依據，從40對EST-SSR引物中篩選多態性良好的引物組合，選取其中引物CA231構建北高叢藍莓栽培種的DNA指紋圖譜、數字指紋圖譜，利用非加權類平均法進行遺傳多樣性分析。結果表明：10個引物對組合共擴增出206個位點，其中多態性位點203個，占98.12%。每條引物的多態性位點數為9～48個，平均每條引物擴增出20.6個位點，平均多態性位點為20.3個。引物CA231擴增位點數最多，多態性比率為100%，且可以鑒別所有試驗材料。構建30個北高叢藍莓栽培品種的指紋圖譜，并對其親緣關系分析表明，在遺傳相似系數為0.52時，30個品種聚為一類，當遺傳相似系數為0.63時，77.7%的品種仍聚為一類。

藍莓； EST-SSR； 指紋圖譜； 遺傳多樣性

藍莓是杜鵑花科越桔屬植物，原產北美，是一種具有極高經濟價值的新興世界性小漿果樹種，適生于疏松的酸性土壤中[1]。藍莓果實酸甜，風味獨特，富含花青素、黃酮醇、原花青素及其他多種酚類復合物，可以改善泌尿系統，防止尿路感染；軟化毛細血管，消除眼睛疲勞；增強心臟功能；提高抗癌能力[2-3]。由于其獨特的營養保健價值，使得消費者需求量不斷增加，種植面積也在持續增長。

近年來，我國藍莓種植面積及其產量持續增長，已成為亞洲地區藍莓生產的主導國。但國內所有的藍莓生產企業均依賴于美國、日本等國家引進品種。在引種過程中，可能是由于人為或其他因素等造成品種間的混亂，單從外部形態特征上很難準確地將其區分開，使得藍莓種苗市場上出現同物異名或者同名異物的現象，給雜交育種及苗木生產帶來阻滯。為了識別假冒偽劣品種，減少種植者的損失，保護育種者的權益，必須用有效的方法檢測藍莓種質資源的真實性，保護藍莓育種者的知識產權。目前，藍莓品種間的區分工作主要通過形態特征觀察和DNA分子標記鑒別2種方法進行。但前者具有易受環境影響、耗時和主觀性強的缺點，而考察結果與實際表現間往往存在比較大的差異。DNA分子標記則不受環境條件的影響，非常適合進行此類研究。EST-SSR標記開發較簡單、快捷、低成本[4]，可鑒定基因組中的變異性，同時，基因組圖譜的建立可以加快后續基因功能的快速鑒定，提高標記輔助篩選的效率[5]。與其他標記相比，EST-SSR更容易獲得基因表達信息，在相關物種間轉移效率更高，更經濟[6]。近年來，EST-SSR分子標記得到廣泛應用。

Rowland等[7]為區分控制藍莓種間二倍體雜交的抗寒與需冷量相關基因的數量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)，用EST-SSR、SNP和RAPD等分子標記技術構建其遺傳連鎖圖譜；Yang等[8]設計136對EST-SSR引物，并用其中36對引物對已登記在冊的150個藍莓品種進行遺傳多樣性、種群結構及親緣多樣性進行分析；Samir等[9]用12對EST-SSR引物序列分析36份野生藍莓和栽培種的遺傳多樣性及遺傳關系。但迄今為止，北高叢藍莓作為栽培種和育種種質中的重要一類，卻無有關北高叢藍莓種內遺傳多樣性和遺傳關系的報道。因此，筆者采用EST-SSR標記技術對30份北高從藍莓種質進行親緣關系和遺傳多樣性分析，并構建指紋圖譜，旨在從分子水平上揭示北高叢藍莓種質間的親緣關系及遺傳多樣性特征，為今后藍莓種質資源的收集、引種和鑒定、雜交育種中親本的選配、分子標記輔助育種等方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由大連森茂現代農業有限公司提供，各品種遺傳背景見表1。

表1 供試藍莓品種的遺傳背景及來源

1.2 植物基因組DNA 的提取

用 TIANGEN新型植物基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，將DNA置于-20℃冰箱中保存備用。

1.3 EST-SSR 的PCR 擴增

試驗使用的40對引物參照Boches[10]等設計，由寶生物工程(大連)有限公司合成。隨機選取5個樣品，分別對40對引物進行PCR擴增反應，篩選多態性較好的引物用于下一步試驗。

EST-SSR反應體系的10×buffer、dNTPs、TaqDNA酶均購自寶生物科技有限公司。EST-SSR的反應體系為 10×buffer (Mg2+Plus) 2 μL、dNTPs 1.6 μL、正反向引物(10 μmol/L)各1 μL、TaqDNA聚合酶0.2 μL，模板100 ng，最后添加滅菌超純水至20 μL。

EST-SSR擴增程序為94℃預變性10 min；94變性40 s，52℃退火70 s，72℃延伸120 s，40個循環；72℃后延伸10 min；4℃保存。擴增在S1000伯樂梯度PCR儀上進行，擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，最終銀染檢測，拍照、分析。

按上述方法對全部材料進行EST-SSR PCR擴增，2次重復。

1.4 數據處理

選擇重復性好且清晰的條帶進行記錄，在相同位置有帶記為1，無帶記為0，構建0、1矩陣，選用l00～2000 bp易于識別的條帶進行統計。采用NTSYSpc 2.0e軟件按類平均法(UPGMA)構建親緣關系聚類圖，對不同品種間的遺傳多樣性進行分析。

2 結果與分析

2.1 藍莓的DNA 檢測

采用試劑盒法提取得到供試藍莓品種的基因組DNA，經0.8%～1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后DNA電泳條帶清晰，亮度均一，濃度適中，符合后續試驗對DNA純度和質量的要求。

2.2 EST-SSR 標記的多態性

隨機選取5個供試品種對40對EST-SSR引物進行篩選，獲得10對多態性高、穩定性好且帶型容易識別的引物，各引物序列及擴增結果(表2)。供試的30份藍莓品種共擴增206個位點，其中多態性位點203個，占98.12%。每條引物的多態性位點數為9～48個，平均每條引物擴增20.6個位點，平均多態性位點為20.3。引物CA231擴增位點數最多，為48個，且其多態性比率為100%。

表2 10對EST-PCR 引物對5個藍莓品種的擴增情況

2.3 EST-SSR 擴增圖譜

每對引物組合均能鑒別供試材料，但鑒別能力不同，CA23可鑒別28個品種，CA94和CA483可鑒別25個品種，CA112和CA236可鑒別15個品種，CA190可鑒別24個品種，CA227可鑒別21個品種，CA791可鑒別27個，CA1920可鑒別22個品種，而引物CA231可鑒別30個品種。引物CA231對30份藍莓品種擴增的EST-SSR圖譜，擴增產物的長度為100～2000 bp(圖1)。

圖1 引物組合 CA231對1～30號藍莓栽培種的擴增圖譜

表3 30個藍莓栽培種的DNA 數字指紋圖譜

2.4 SSR 的數字指紋圖譜

CA231在30個供試藍莓品種中的擴增結果，在相同位置有帶記為 1，無帶記為0，構成每個品種的數字指紋圖譜(表3)，這些數碼分別對應相應的SSR編碼，可以作為藍莓栽培種的分子身份證。

2.5 藍莓的聚類樹

由圖2可見，當相似系數為0.63時，可將供試材料聚為4個大類，1個大聚類組B和3個較小聚類組A、C、D。A組只包含1號品種大粒藍金，來源于藍金的實生苗選育。B組包括23個品種，占供試材料的76.67%。在相似系數為0.69時，B組可被分為3個亞組，即B1、B2、B3。B1亞組有5個品種，其中9號來自澳大利亞，從藍空的自然實生苗中選育而得。B2亞組包含16個品種，在相似系數為0.77時，可進一步分為3組。第①組包括3號(維口)、5號(公爵)、4號(藍塔)，這3個品種都與早藍有血緣關系，其中藍塔和斯巴坦都是早藍的雜交子一代；第②組有11個品種，這11個品種又根據其遺傳相似度進行聚類，其中7號(日出)和28號(雙迪)、8號(藍片)和11(陶柔)號的關系最為緊密；第③組包括6號(斯巴坦)、14號(柏林頓)2個品種，分別來自美國北卡羅拉納州和澳大利亞維多利亞。B3亞組含2個品種，即17號和18號，分別來自美國新澤西州和澳大利亞維多利亞。C組包含5個品種，均由美國農業部發布。D組只有13號品種，由美國農業部發布。

圖2 30個藍莓栽培種的聚類樹

Fig.2 Dendrogram of 30 cultivated blueberry based on EST-SSR analysis

3 結論與討論

DNA分子標記技術具有簡單、快速、高效的特性，已被廣泛用于種質資源的遺傳多態性分析[11]、作物指紋圖譜構建[12-13]和遺傳連鎖圖譜研究[14]中。分子標記主要包括AFLP、RFLP、RAPD、ISSR、EST-SSR、SRAP、TRAP等，其中EST-SSR標記因其高分辨力特性及其共顯性遺傳方式已成為作物DNA指紋分析和圖譜構建非常理想的技術。任紅曉等[15]用39對SSR引物分析了78份中國北方名優綠豆品種的遺傳多樣性表明，內蒙古是傳統名優綠豆種質資源最豐富的地區；薛建峰等[16]從171對SSR及EST-SSR引物中篩選10對，構建30份國內蓖麻品種和1份法國蓖麻品種的指紋圖譜，并進行遺傳多樣性和親緣關系分析；也有研究者[17]利用25個表型性狀和33對SSR標記對53份五節芒種質資源的遺傳多樣性進行了評價，證明五節芒種質具有豐富的遺傳多樣性；段艷鳳[18]利用篩選出的6對SSR引物構建88份馬鈴薯的指紋圖譜，并進行聚類分析結果與供試材料系譜來源有較好一致性。隨著物種間遺傳多樣性研究工作的不斷開展，EST-SSR分子標記得到廣泛應用，如在菠蘿[19]、核桃[20]、柑橘[21]、葡萄[22]、杏[23]、梨[24]及蘋果[25]等物種中均有研究。近年來，在越桔屬植物中也有廣泛的應用[26-28]。本研究利用EST-SSR標記構建了30個藍莓品種的2種形式的DNA指紋圖譜，即EST-SSR PCR擴增指紋圖譜、數字指紋圖譜。擴增指紋圖譜是分子標記試驗最原始、最基礎，也是最重要的DNA指紋圖譜，是遺傳多樣性分析、親緣關系分析、種質資源評價鑒定、遺傳圖譜繪制及其他形式DNA指紋圖譜構建的原始資料。DNA數字指紋圖譜是每個品種的身份證編碼，可簡單有效的辨別。傅冰等[29]、李紅俠等[30]、王程等[31]、鄭珊等[32]都在不同層面上構建了藍莓的擴增圖譜。

本研究利用篩選出的10對穩定性好、分辨率高的引物構建了30個供試品種的指紋圖譜，這些引物的多態性比率為90.15%～100%，平均多態性比率為98.12%，其中只用引物CA231可以將這些材料逐一區分開，證明了研究結果的準確性，也表明本研究選用的EST-SSR標記分辨力極高，為構建藍莓遺傳連鎖圖譜，進一步研究與抗寒、需冷量等性狀相關基因提供參考。同時，本研究構建的DNA指紋圖譜也將為藍莓種植戶進行品種真偽鑒定、保護該品種提供一定的科學依據，這將逐步改善藍莓產業苗木市場混亂的現象。另外，本研究中有些聚類分析結果與實際親緣關系不符合，如14號卡羅琳藍和18號布里吉塔都是從Lateblue的實生苗中選育而來，被分在不同的組中，說明來源于同樣實生苗的后代在不斷雜交過程中內部遺傳信息可能發生改變，即內部遺傳物質發生了變異，這在今后的研究工作中，可通過測序手段對其差異片段進行序列分析，根據同源性比對結果深入分析內部遺傳物質發生變異的情況。

本研究結果表明，北高叢藍莓品種間遺傳基礎狹窄，在遺傳相似系數為0.52時，30個品種聚為一類，當遺傳相似系數為0.63時，77.7%的品種還聚為一類，說明按照種植區域分類的品種間內部遺傳物質變異程度小，若想改變北高叢藍莓品種間的遺傳信息量，獲得新性狀的藍莓品種，則需要加強野生種質資源的利用或者進行種間雜交，以提高后代變異的幾率，該研究結果與崔建民等[27]研究結果一致。今后，筆者還將更加系統地開展不同種植區域品種間遺傳多樣性的研究，如北高叢藍莓、南高叢藍莓、半高叢藍莓、兔眼藍莓以及紅豆越桔間遺傳多樣性的研究，可以在遺傳背景較遠的品種間開展雜交育種工作，利用分子標記可以加快育種速度，同時再結合染色體倍性研究結果，快速地開展種間雜交育種工作，為更快、更好地開發具有我國自主知識產權的藍莓新品種提供理論依據。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Fingerprinting Construction and Genetic Relationship Analysis of Blueberry Based on EST-SSR Markers

GAO Xiongmei1, XU Guohui2*, WANG Hexin2, HOU Yilong1

(1.LifeScienceandTechnologyCollege,DalianUniversity,Dalian,Liaoning116622; 2.InstituteofModernAgriculturalResearch,DalianUniversity,Dalian,Liaoning116622,China)

To provide basis for cultivar identification and apolegamy of excellent hybridization combination at the molecular level, EST-SSR markers were employed to analyzeon fingerprinting and genetic diversity of north highbush blueberry cultivars. Ten of 40 pairs of EST-SSR primers were screened out based on five cultivars which were selected randomly. The 10 primer pairs amplified a total of 206 alleles (including 203 polymorphic alleles) among the 30 cultivars, and the ratio of polymorphism was as high as 98.12%. Alleles amplified by each pair of primers ranged from 9 to 48, with a mean of 20.6, and the mean of polymorphism alleles for each pair was 20.3. 30 cultivars were univocally identified using only one EST-SSR primer pair(CA231), which one’s alleles was the most and the ratio of polymorphism was 100%. UPGMA cluster analysis of genetic relationship between cultivars showed that all the materials were clustered into one group at the genetic similarity coefficient of 0.52, and 77.7% of the cultivars were still clustered together at the genetic similarity coefficient of 0.63.

blueberry; EST-SSR; fingerprinting; genetic diversity

2015-09-09； 2016-02-28修回

遼寧省博士科研啟動基金項目“高叢藍莓自然雜交優良品系的篩選及其DNA指紋鑒定”(20141120)；遼寧省科技計劃項目“藍莓樹莓種質資源創新及優質高效栽培技術研究”(2013204001)；藍莓優良新品種的選育及推廣應用(XDNY-NYKJ-2015-001)；大連金州國家農業科技園區科技計劃項目“藍莓優良品種高效栽培技術示范”(2014-004)；昆明市科技計劃項目“藍莓品種選育及關鍵栽培技術創新”(2014-04-A-N-01-3099)

高雄梅(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：植物遺傳育種。E-mail:gaoxm13@163.com

*通訊作者： 徐國輝(1980-)，女，講師，博士，從事遺傳育種學研究。E-mail:xugh520@163.com

1001-3601(2016)04-0172-0110-06

S663.9

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