藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究

賀　平　朱曉莉　劉　航　李　捷

1.西藏民族大學醫學院，陜西　咸陽　712082；2.陜西省咸陽市中心醫院，陜西　咸陽　712000

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藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究

賀平1朱曉莉2劉航1李捷1

1.西藏民族大學醫學院，陜西咸陽712082；2.陜西省咸陽市中心醫院，陜西咸陽712000

【摘要】目的:觀察藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性，為臨床用藥提供實驗依據。方法:采用瓊脂平板打孔法研究十五味龍膽花丸對3種標準菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、沙門菌CMCC50319)及12株臨床菌株的抑菌作用，并檢測小鼠含藥血清對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結果:十五味龍膽花丸對金黃色葡萄球菌有明顯的體外抑菌作用，但對革蘭陰性菌抑菌作用較弱。對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度介于6.25～12.5mg/ml。結論:十五味龍膽花丸對耐藥性金黃色葡萄球菌有一定的體外抑菌作用。

【關鍵詞】十五味龍膽花丸；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；抑菌

藏藥生境獨特，藥理功效強，引起了國內外的廣泛關注。十五味龍膽花丸系藏醫經典方劑，始載于藏醫巨著《四部醫典》，藏文名“幫間久埃”，為棕灰色水丸，氣微香，味甘、辛、苦。主要由白花龍膽、檀香、訶子(去核)、余甘子、石灰華、廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、無莖芥、甘草、毛訶子、木香、寬筋藤等15味藥材組成。具有清熱利肺、止咳化痰、平喘的功效[1]。目前，十五味龍膽花丸的研究主要集中在成分檢測[2-6]及臨床療效觀察，并用于治療支氣管炎[7]、咳嗽哮喘[8]、咽炎[9]等，尚未見藥理研究的文獻報道。研究旨在探討十五味龍膽花丸消炎抗菌作用原理，為臨床用藥提供實驗依據。

1材料

1.1藥物與實驗動物十五味龍膽花丸(西藏民族學院附屬醫院，每10丸0.3 g)。青霉素、卡那霉素標準藥敏紙片(康泰生物有限公司)。實驗動物均為雌性昆明小鼠(NO.61001700000554,SPF級)，體重(20±2)g由西安交通大學實驗動物中心提供。

1.2實驗菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923 (Staphylococcus aureus)、大腸桿菌ATCC25922 (Escherichia coli)、沙門菌CMCC50319(Salmonella)均由西安交通大學醫學院提供；耐藥性金黃色葡萄球菌5株、銅綠假單胞菌2株、耐藥性肺炎克雷伯菌2株、耐藥性大腸桿菌3株，由咸陽市中心醫院檢驗科提供，菌株信息見表1。

表1　供試菌株來源及耐藥情況

1.3儀器Dade AutoScan-4半自動化細菌鑒定系統；BHC-1300ⅡA/B2型超凈工作臺(蘇凈集團)；Eppendorf 微量移液器； PH140A型干燥/培養箱(上海一恒科技有限公司)；DENVER T-214電子天平；GZX-9070 MBE數顯鼓風干燥箱和YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司)；ZH-2型渦旋混合器；游標卡尺。

2方法

2.1藥物準備準確稱量藥物，然后在100 ml純水中浸泡30 min，用文火煮沸30 min，冷卻后離心取用上清液，并用少量純水沖洗沉渣兩次，沖洗液離心后取用上清液，將三次上清液合并濃縮至1000 mg/ml，用除菌濾器過濾后放置4℃備用。

2.2菌液制備將供試菌株在37℃培養18～20 h，取新鮮菌落用無菌水稀釋成0.5麥氏比濁度的菌液，然后用平板涂布法進行體外抑菌實驗。

2.3平板打孔法抑菌實驗參照文獻[10]用打孔器在M-H瓊脂平板上等距離打6個的孔(直徑6.5 mm)，然后用無菌棉簽蘸取0.5麥氏比濁度的菌液均勻涂布于平板，每個孔內加100 μl藥液。根據預實驗結果設置600、200、60 mg/mL三個濃度水平，以卡那霉素與青霉素藥敏紙片作為對照。將平板37℃孵育24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每株菌種做三個平行，并求取抑菌圈平均值。

2.4最小抑菌濃度(MIC)測定參照文獻[11]采用微量肉湯稀釋法測定敏感菌株MIC。取7支無菌試管，第一管加1.5 ml營養肉湯，其余各管均加1 ml營養肉湯；取0.5 ml 200mg/ml藥液加入第一管渦旋30 s，混勻后從第一管取1ml至第二管，依次倍比稀釋至第6管，最后從第6管取1 ml棄掉，藥物濃度梯度為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 mg/ml。用移液器依次向1～7支試管加入50 μL 0.5麥氏比濁度的菌液并混勻，第7管不加藥物做陽性對照，另設無菌肉湯培養基做陰性對照，將所有試管置于37℃孵育24 h。將試管內培養液接種M-H瓊脂培養18～20 h，以無菌落生長的試管作為該菌株的最小抑菌濃度。每個實驗做三個平行，并求取MIC平均值。

2.5血清學抑菌實驗根據打孔法抑菌實驗結果，研究藥物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。按照藥物使用說明書和計量換算表確定小鼠給藥中等劑量(0.625mg/ml)。低、中、高劑量組之間均相差3倍。經灌胃方式給藥，連續給藥5天后分離含藥血清，然后進行含藥血清抑菌實驗。每株菌種做三個平行，并求取抑菌圈平均值。

3結果

3.1標準菌株抑菌結果由表2可知，十五味龍膽花丸對金黃色葡萄球菌ATCC25923有顯著的體外抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關；對G-菌株無抑菌作用較弱，600 mg/ml藥物對大腸桿菌ATCC25922與沙門菌CMCC50319均未形成抑菌圈。

±s,n=3)

注：“-”表示無抑菌圈；“±”抑菌圈直徑小于8mm；卡那霉素與青霉素藥敏紙片為質控對照。

3.2臨床菌株抑菌結果由表3可知，十五味龍膽花丸對5株耐青霉素的金黃色葡萄球均有顯著抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關，但是對菌G-臨床菌株抑菌作用較弱，僅在高濃度時對銅綠假單胞菌有抑菌圈形成。

±s,n=3)

注：與青霉素比較，*P<0.001；“-”表示無抑菌圈；卡那霉素與青霉素藥敏紙片為質控對照。

3.3MIC測定觀察試管中培養基透明度，同時轉種M-H瓊脂培養基觀察細菌生長情況，得出敏感菌株的最小抑菌濃度。由表4可知，金黃色葡萄球菌MIC介于6.25～12.5 mg/ml。

3.4血清學抑菌實驗十五味龍膽花丸對金黃色葡萄球菌的血清藥理學抑菌實驗表明，低、中、高劑量給藥組的小鼠含藥血清抑菌實驗結果均為陰性。所用藥物為十五味龍膽花丸藥粉與純水制備的混懸液，在高劑量組(1.875 mg/g-)灌胃時發現藥液比較粘稠，小鼠灌胃給藥過程相對比較困難，因此未采取提高給藥劑量來增加藥物血藥濃度的措施。

表4　肉湯稀釋法測定金黃色葡萄球菌MIC　 (n=3)

注：“-”無菌落形成；“±”形成少量菌落；“+”形成大量菌落；“++”細菌生長形成菌苔。

4討論

十五味龍膽花丸由白花龍膽、檀香、訶子、丁香、巴夏嘎、木香等配伍而成。其君藥為白花龍膽，《晶珠本草》記載龍膽花性味苦寒無毒，主治各種喉癥，其活性與龍膽苦苷有關，后者具有清熱瀉火、鎮咳利喉的作用[12]。訶子為獨特的珍稀藏藥材，具有廣譜抗菌作用。訶子提取物對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌[13]和耐藥性鮑曼不動桿菌[14]有顯著的抑菌作用，但對大腸桿菌較弱。丁香中也是該方劑主要活性成分之一，丁香對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及沙門菌有明顯的抑菌作用[15]。本研究首次探討了十五味龍膽花丸的體外抑菌作用，發現該藥對耐藥性金黃色葡萄球菌有顯著抑菌作用，對銅綠假單胞菌抑菌及沙門菌也有一定抑菌作用，對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌則無抑菌作用，與上述方劑組分的研究報道基本一致。根據Dade AutoScan-4細菌鑒定結果，本研究中耐藥性金黃色葡萄球菌均為MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)，該菌已成為全球醫院感染的主要病原體之一[16]，提示十五味龍膽花丸具有較好的臨床應用前景。

藏藥方劑與中草藥方劑的藥物成分比較復雜，不同成分之間存在擴散差異，而且沒有標準紙片，實驗結果質量較難控制。中藥體外抑菌實驗常用的研究方法[17]主要包括：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、紙片擴散法、牛津杯法、打孔法等。牛津杯法、打孔法與紙片擴散法原理相似，操作簡便，而且藥液擴散相對均勻。研究結果顯示，牛津杯法擴散速度較慢，24h后部分牛津杯中仍有尚未擴散的藥液，而且形成抑菌圈的效果較差。因此本研究的抑菌實驗均采用平板打孔法。

十五味龍膽花丸方劑的化學成分極其復雜，經口服以后在體內會發生一系列變化，含藥血清能更好的反映藥物在體內環境中產生藥理效應的真實過程，特別適合復方進行藥效評價及其作用機制的研究。所以在平板打孔法抑菌實驗的基礎上，采用血清藥理學方法進一步研究了小鼠含藥血清對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。低、中、高劑量給藥組抑菌實驗結果均為陰性。由此推測十五味龍膽花丸體內抗感染療效并不完全依賴血清藥物濃度，可能通過調節機體免疫功能等途徑實現抗炎止咳的療效。且有研究表明訶子可以調節細胞因子分泌，從而有效地增強機體非特異性免疫功能[18]；丁香具有抗菌和增強體液免疫的作用[15]。因此有必要進一步考察該藥物對機體免疫功能的影響。

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Antibacterial activity of Tibetan Medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro

HE Ping1*ZHU Xiaoli2LIU Hang1LI Jie1

1.Department of Pathogenic Biology,Medical School,Xizang Minzu University,Xianyang 712082,China;

2.The central hospital of Xianyang, Xianyang 712000,China

Abstract:Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro and provide theoretical basis for clinical application. Methods M-H agar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of Shiwuweilongdanhua pills on three standard strains (Staphylococcus aureus ATCC25923, Escherichia coli ATCC25922, Salmonella CMCC50319) and 12 clinical isolates; and the antibacterial effect of mice serum on Staphylococcus aureus was detected.Result Shiwuweilongdanhua pills had obvious antibacterial effect on Staphylococcus aureus in vitro, but weak inhibition on Gram-negative bacteria. The minimal inhibitory concentrations to Staphylococcus aureus were between 6.25mg/ml and 12.5mg/ml.Conclusion Shiwuweilongdanhua pills had significant antimicrobial effect on multidrug-resistant Staphylococcus aureus in vitro, which indicated potential prospects in clinical application.

Key words:Shiwuweilongdanhua pills; Staphylococcus aureus; Escherichia Coli; Antibacterial activity

(收稿日期：2015.12.06)

【中圖分類號】R29

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)01-0003-03

作者簡介：賀平，醫學碩士，從事藏藥抗菌作用研究。 E-mail:hepingyixue@126.com

基金項目：西藏民族大學校級科研項目(14myQ14)。