Box—Behnken設計—效應面法優化蓮心堿羥丙基—β—環糊精包合物制備及表征

周江　吳婷婷　李美云　雷小小　唐婷　桂卉

摘要：目的 優選蓮心堿羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）包合物的最佳制備工藝，考察蓮心堿HP-β-CD包合物體外溶出性質。方法 采用飽和水溶液法制備包合物，以45 min體外累積溶出度為指標，采用三因素三水平Box-Behnken設計，考察HP-β-CD與蓮心堿投料比、攪拌時間、包合溫度對制備工藝的影響，對結果進行多元線性和二項式擬合，效應面法篩選出最佳包合工藝，進行預測分析和驗證試驗，并應用顯微電鏡掃描法、差示量熱掃描法、紅外光譜、X射線衍射法對包合物進行結構表征。結果 蓮心堿HP-β-CD包合物的最佳制備工藝為：HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.5倍，攪拌時間為3.7 h，包合溫度為52 ℃。表征鑒定結果顯示蓮心堿HP-β-CD包合物已形成。結論 本研究優選的最佳包合工藝穩定可行，能顯著提高蓮心堿的溶出度，增加其生物利用度。

關鍵詞：蓮心堿；羥丙基-β-環糊精；包合物；Box-Behnken設計-效應面法；累積溶出度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.022

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0080-05

Abstract： Objective To optimize the preparation of liensinine HP-β-CD inclusion compound； To investigate its dissolution performance in vitro. Methods The inclusion compound of liensinine was prepared by using saturated water solution method； the cumulative dissolution （45 min） was used as an indicator and Box-Behnken design was adopted to evaluate the influence of feed ratio， mixing time and inclusion temperature on preparation process. Results were analyzed by multiple linear and binomial fitting； response surface methodology was used to screen the optimal inclusion process； predictive parsing and verification experiment were conducted； SEM， DSC， IR， and XRD were applied for the structural characterization of inclusion compound of liensinine. Results The optimal preparation process was： HP-β-CD was 4.5 times the amount of liensinine feeding amount； mixing time was 3.7 h； inclusion temperature was 52 ℃. HP-β-CD inclusion compound of liensinine formed. Conclusion Optimal inclusion process is stable and feasible， which can significantly improve the dissolution of liensinine and increase its bioavailability.

Key words： liensinine； HP-β-CD； inclusion compound； Box-Behnken design； cumulative dissolution

蓮心堿（liensinine）是中藥蓮子心中含量較高的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有降壓、抗心律失常、抗氧化、對抗血栓形成等作用[1-3]，具有良好的開發應用前景。但蓮心堿在水中溶解度差，口服溶出速率較慢，極大地限制其臨床應用。通過增加其在體外的溶出速率有望提高蓮心堿在體內的生物利用度。包合技術具有增加藥物溶解度、降低藥物刺激性、減少毒性、提高藥物穩定性、提高生物利用度等優點[4-5]。本研究采用相溶解度法考察羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）對蓮心堿的增溶作用，以體外45 min累積溶出度為指標，通過Box-Behnken試驗設計優化蓮心堿HP-β-CD包合物的制備工藝，運用顯微電鏡掃描法、差示量熱掃描法、紅外檢測法、X射線衍射法對蓮心堿HP-β-CD包合物進行物相鑒定。

1 儀器與試藥

傅里葉紅外掃描儀（FTIR-8000，日本島津公司）；ZRS-8G型溶出儀（天津大學無線電廠）；756PC型紫外分光光度儀（上海奧普勒有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華有限責任有限公司）；CP-114型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；X衍射掃描儀（北京宏昌信科技有限公司：XRD系列）；差示量熱掃描儀（美國TA公司，Q2000）；REM電子掃描儀（FEI公司，Quanta-200）。

蓮心堿標準品（上海源葉生物有限公司，HPLC純度≥98%，批號20121122）；蓮心堿（自制，含量≥50%）；HP-β-CD（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制

在200～700 nm進行全波長掃描，結果顯示在282 nm處包合物中蓮心堿及蓮心堿標準品均有最大吸收。配制不同濃度蓮心堿標準品，測量其吸光度值，得線性回歸方程：Y=0.139X+0.018 3，r=0.999 2。

2.2 精密度試驗

精密量取標準品溶液（0.10 mg/mL）1 mL，用甲醇定容至10 mL，取6份標準品溶液各1 mL，按標準曲線方法操作，測量吸光度值分別為0.119、0.117、0.120、0.120、0.120、0.121，計算得RSD=0.65%，結果表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗

精密量取蓮心堿標準品（0.10 mg/mL）1 mL，定容至10 mL，每隔2 h取樣，于282 nm處測定紫外吸光度值，分別在0、2、4、6、8、12 h測得吸光度值為1.328、1.340、1.344、1.335、1.343、1.332，平均值為1.337，RSD=0.206%（n=6）。結果表明蓮心堿標準品溶液在12 h內較穩定。

2.4 相溶解度法

在HP-β-CD濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.125、0.2 mol/L的水溶液中（100 mL）添加蓮心堿提取物0.5 g（含蓮心堿4 mg），于25 ℃磁力攪拌，讓其平衡4 h，溶解平衡后取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，測量其吸光度值，計算蓮心堿的表觀溶解度，以HP-β-CD溶液濃度為橫坐標、蓮心堿的表觀溶解度為縱坐標，繪制平衡相溶解度曲線。結果表明，在0～0.2 mol/L范圍內，隨著HP-β-CD濃度的增加，蓮心堿的表觀溶解度呈良好的線性增加，其相溶解度方程為Y=0.828 0X+0.225 0，r2=0.999 1。說明蓮心堿與HP-β-CD以摩爾比1∶2的比例（質量比約1∶4）進行包合，且HP-β-CD具有提高蓮心堿溶解度的作用[6]。

2.5 累積溶出度測定

按照2010年版《中華人民共和國藥典》（二部）附錄ⅩC溶出度測定方法（槳法）測定溶出度。取樣品各1 g，以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質，轉速為100 r/min，分別在0、3、8、10、20、30、45 min時取樣7 mL（取樣后立即補充等量的溶出介質），過0.45 μm微孔濾膜，取濾液作為供試品，在282 nm處測定其吸光度值，按下式計算累積溶出百分率。

q（%）=[Cq×V1+（C1+C2+…+Cq-1）×V2]/M/1000×100%

其中，q（%）為第q個取樣點時的累積溶出百分率；Cq為第q個取樣點時的藥物濃度；V1為溶出介質的總體積，V1=1000 mL；V2為每次取樣的體積，V2=7 mL；M為稱取的樣品含蓮心堿的量。

精密稱取蓮心堿原料藥3份，分別為1.01、0.99、1.01 g，按上述方法測得3份原料藥樣品45 min累積溶出度分別為22.70%、21.34%、22.59%，樣品累積溶出度平均值為22.54%。

2.6 Box-Behnken設計-效應面分析法優選包合物制備工藝

2.6.1 試驗設計與結果 通過預試驗得知，采用飽和水溶液法制備蓮心堿包合物對蓮心堿的增溶效果較好，影響包合物包合的主要因素為藥物與HP-β-CD比例、攪拌時間、包合溫度，每個因素設計3個水平（低、中、高分別以-1、0、1進行編碼），因素水平見表1。以包合物中蓮心堿的累積溶出百分率（Y）為指標，篩選蓮心堿包合的最佳工藝，按Box-Behnken試驗設計的統計學要求，各組試驗安排及結果見表2，模型方差分析見表3。

2.6.2 模型擬合及顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.05軟件對上述試驗數據進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程模型為：Y=-401.896 50+21.450 50A+3.944 88B+16.325 12C-0.461 25AB-0.232 25AC+0.125 62BC-0.854 44A2-1.147 56B2-0.150 70C2，決定系數R2=0.891 1。對該回歸模型及其系數進行方差分析，結果顯示該模型方程達到極顯著水平（P<0.01），且失擬項不顯著（P>0.05），表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確預測實際情況。其校正決定系數（R2adj）為0.971 2，表明此模型能解釋97.12%效應值變化，因此該模型擬合程度良好，試驗誤差小，僅有約4%不能由此模型進行解釋。

2.6.3 效應面的優化與分析 根據回歸分析結果，采用Design-Expert8.05軟件做三維圖（見圖1）。從曲面圖和等高線圖可以直觀看出，HP-β-CD用量和包合溫度對包合物的溶出性能有極其顯著的影響（P<0.001），而攪拌時間對溶出性能的影響次之。當HP-β-CD用量、攪拌時間及包合溫度逐漸增加時，包合物的溶解性能均為先增大后減小。當HP-β-CD用量約為4倍、攪拌時間約4 h、包合溫度約50 ℃時，包合物的45 min累積溶出度接近最大值。根據本試驗目的，要求包合物累積溶出度越大越好，通過Design-Expert8.05軟件可找到最佳包合工藝參數，即HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.45倍，攪拌時間為3.68 h，包合溫度為52.26 ℃。

2.6.4 模型的預測與驗證 考慮到實際操作方便，將最佳包合工藝修正為：HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.5倍，攪拌時間為3.7 h，包合溫度為52 ℃。在此條件下，蓮心堿包合物的45 min累積溶出度的理論值為79.77%。按修正后的最佳包合工藝進行驗證試驗，測得的蓮心堿45 min累積溶出度為（78.58±1.21）%。與理論預測值比較接近，說明此模型擬合度高，基于Box-Behnken設計所得的最佳包合工藝參數準確可靠。

2.7 蓮心堿羥丙基-β-環糊精包合物表征

2.7.1 蓮心堿包合物的制備 以HP-β-CD為包合物的載體，采用飽和水溶液法制備包合物，精密稱取HP-β-CD 4.5 g溶于30 mL蒸餾水中，蓮心堿1 g以20 mL甲醇溶解，超聲10 min，混合，置于磁力攪拌機中攪拌3.7 h，控制水浴溫度為52 ℃，加熱揮干多余的溶劑及水分，40 ℃真空干燥，過80目篩。

2.7.2 蓮心堿與羥丙基-β-環糊精物理混合物的制備 以質量比1∶4.5比例準確稱量蓮心堿與HP-β-CD，置于研缽中充分混合，得到蓮心堿與HP-β-CD的物理混合物。

2.7.3 顯微電鏡掃描 25 kV加速電壓下，用掃描電鏡直接觀察蓮心堿、HP-β-CD、蓮心堿與HP-β-CD物理混合物及蓮心堿HP-β-CD包合物，結果見圖2。可見，蓮心堿主要呈現出少量片狀晶體，HP-β-CD擁有獨特的腔內疏水及腔外親水的“錐筒”狀空腔，而在包合物中未見蓮心堿晶體狀物質存在，因蓮心堿已高度分散在HP-β-CD中，掩蓋了蓮心堿晶體，表明蓮心堿包合物已形成。

2.7.4 紅外光譜特征 取適量蓮心堿、HP-β-CD、蓮心堿與HP-β-CD物理混合物、蓮心堿HP-β-CD包合物，用紅外燈干燥后，與KBr混合，置于瑪瑙研缽中研磨成粉末，在相同條件下檢測其紅外吸收光譜，掃描范圍為400～4000 cm-1，紅外光譜圖見圖3。蓮心堿的羥基峰位在3400 cm-1，羰甲基峰位在2359 cm-1左右。在2359 cm-1附近HP-β-CD沒有吸收，蓮心堿與HP-β-CD物理混合物中表現出了該特征峰，而包合物在此波數附近無吸收。在3400 cm-1附近的-OH吸收峰比較寬，表明HP-β-CD與蓮心堿形成了氫鍵，物質特征峰發生了明顯的變化，故包合物形成[7-8]。

2.7.5 差示掃描量熱分析 氣氛為N2，10 ℃/min速度升溫，將蓮心堿、HP-β-CD、蓮心堿與HP-β-CD物理混合物、蓮心堿HP-β-CD包合物封閉在鋁制坩堝中，調節溫度在30～300 ℃范圍內進行差示量熱掃描，差示掃描升溫曲線見圖4。由圖可知，蓮心堿在115 ℃出現1個較大的吸熱峰。蓮心堿與HP-β-CD物理混合物在115 ℃及80 ℃出現了2個吸熱峰，分別為蓮心堿與HP-β-CD的熔點峰，而蓮心堿HP-β-CD包合物在115 ℃無吸熱峰，只存在80 ℃的HP-β-CD特征峰，表明固體分散體中不存在蓮心堿的結晶，蓮心堿是以非定型狀態均勻分散在HP-β-CD中，即形成了包合物[9-10]。

2.7.6 X線衍射分析 取適量蓮心堿、HP-β-CD、蓮心堿與HP-β-CD物理混合物、蓮心堿HP-β-CD包合物的粉末，進行X線衍射，壓片法制片，采用Cu靶，KA線，掃描范圍5°～75°，加速電壓為40 kV，掃描速度8°/min。X線衍射結果見圖5。由圖可知，蓮心堿存在較多的特征峰，如在12.5°～52.66°之間有4處較大的吸收。HP-β-CD在此范圍內有10.64°、18.98°處2個較大的衍射峰。蓮心堿與HP-β-CD的物理混合物的衍射峰型基本上為兩者的疊加，保留了蓮心堿與HP-β-CD的所有特征峰；而蓮心堿固體分散體的衍射圖譜與HP-β-CD的衍射圖譜基本上一致，特征晶體的衍射峰全部消失，僅保留了HP-β-CD的2個特征峰，表明蓮心堿以無定型狀態均勻分散在載體中，形成了包合物[11-12]。

3 討論

本試驗曾經采用研磨法及噴霧干燥法制備蓮心堿包合物，發現研磨法制備的包合物對蓮心堿的增溶作用不明顯，且操作時間長，從實際生產來看，不適合大量生產；噴霧干燥法制備蓮心堿包合物，收率較低，且操作工序復雜。飽和水溶液法制備包合物對蓮心堿的增溶效果較明顯，且工序簡單，故采用飽和水溶液法制備蓮心堿包合物。

本試驗采用相溶解度法測定蓮心堿的表觀溶解度，表明蓮心堿的表觀溶解度與HP-β-CD成良好的線性關系（投料比1∶1～1∶4），此時HP-β-CD能顯著提高蓮心堿在水中的溶解度，可大大提高蓮心堿的生物利用度。在此基礎上，采用Box-Behnken設計-效應面法安排試驗，并對數據進行二次回歸方程模型的擬合及方差分析，得到可靠數據模型優選出蓮心堿HP-β-CD包合物的最佳制備工藝，制備的包合物提高了蓮心堿的體外溶解度，為蓮心堿及蓮心堿相關制劑的開發奠定了基礎，也為包合技術用于增加難溶性藥物的溶解度和生物利用度提供了依據。

本研究采用顯微電鏡掃描法、差示量熱掃描法、紅外檢測法、X射線衍射法對包合物進行表征鑒定，可以確定蓮心堿以非晶體狀態存在于包合物中，蓮心堿HP-β-CD包合物已形成。由于HP-β-CD具有上窄下寬兩端開口環狀中空圓筒形截椎體的鏤空結構，難溶性蓮心堿分子能進入HP-β-CD的空腔結構內，與空洞內部的碳氫鍵和醚鍵形成穩定的包合物結構。包合物在結構上仍保留了環糊精原有的空腔結構，又因HP-β-CD結構外部的親水性，水溶性強，故蓮心堿被包合后溶出度提高。

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（收稿日期：2015-05-06）

（修回日期：2015-07-09；編輯：陳靜）