香椿子多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

丁世洪，劉兵，趙淑偉，李義清，李萬忠

1.濰坊醫學院，山東 濰坊 261053；2.昌樂縣中醫院，山東 濰坊 262400

香椿子多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

丁世洪1，劉兵1，趙淑偉2，李義清1，李萬忠1

1.濰坊醫學院，山東 濰坊 261053；2.昌樂縣中醫院，山東 濰坊 262400

目的 優選香椿子多糖提取工藝條件，初步確定其體外抗氧化活性。方法 以香椿子多糖含量為評價指標，提取時間、選擇料液比、提取次數為考察因素，采用L9（34）正交試驗設計優選提取工藝；采用總還原力法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法測定香椿子多糖抗氧化能力。結果 香椿子多糖水提工藝優化條件為液料比1∶12，提取120 min，提取3次。香椿子多糖具有一定還原能力，對DPPH自由基（DPPH·）具有較好清除能力，隨多糖濃度增加清除能力增強，并對曲線進行了方程擬合。結論 該工藝簡便可行、穩定可靠，適合香椿子多糖提取的小試研究。香椿子多糖具有一定的抗氧化活性。

香椿子多糖；提取工藝；抗氧化

香椿是一種資源豐富、用途廣泛、成本低廉、藥食兩用的植物，具有較好開發利用價值。香椿子系楝科植物香椿的果實。據《四川中藥志》記載，香椿子性溫、味辛苦，無毒，入肝、肺經，具祛風、散寒、止痛功效，主治風寒感冒、心胃氣痛、風濕關節痛等。香椿子中含有酚類、鞣質、生物堿、皂苷、甾體、萜類、揮發油、多糖等成分[1-4]。植物來源多糖具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、調節免疫力、抗衰老、抗疲勞等生物活性[5-6]。為了更好地開發和利用香椿子資源，本研究初步探討香椿子多糖提取工藝及體外抗氧化活性，為香椿子深入開發和生物活性評價奠定基礎。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計UV-800A型（上海元析儀器公司）；電子分析天平EL204（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗儀PS-30（深圳市深華泰超聲洗凈設備有限公司）；旋轉蒸發器RE-52系列（上海亞榮生化儀器廠）；精密電熱恒溫三用水箱HH600-2B（上海比朗儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱101-1AB（天津市泰斯特儀器有限公司）；KDM型調溫電熱套（山東鄄城創新儀器有限公司）。

香椿子購于購自濟南圣科技術開發有限公司，經濰坊醫學院生藥學教研室許崇梅博士鑒定為楝科香椿屬植物香椿Toona sinensis（A.Juss.）Roem.的果實；葡萄糖及其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 香椿子多糖鑒別方法

精密稱取樣品適量，加水溶解，取樣品溶液1 mL，加1～3滴5％ α-萘酚乙醇溶液，搖勻后沿試管壁緩緩加入濃硫酸，觀察是否在中間出現紫環現象[7]。試驗中出現紫環現象，說明樣品中含有多糖類物質。

2.2 香椿子多糖含量測定

參照文獻[8]，精密稱取葡萄糖對照品50 mg，于容量瓶中加水定容，制成0.5 mg/mL對照品溶液，備用。精密稱取苯酚6.0 g，置棕色容量瓶中，加水溶解搖勻，即得6％苯酚溶液（4 ℃保存）。精密移取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL對照品溶液，定容于50 mL容量瓶中。分別從中精密移取2 mL于10 mL具塞試管中，加入6％苯酚1.0 mL，再加入5.0 mL濃硫酸混勻，靜置10 min，25 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，以2 mL蒸餾水為空白同上操作，于490 nm處測定各樣品吸光度。以多糖含量（mg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得直線方程為Y＝15.767X－0.059 8，r＝0.999 0。精密稱取香椿子多糖適量，按上述方法測定樣品吸光度，由方程計算樣品中多糖含量。

2.3 香椿子多糖提取工藝研究

2.3.1 香椿子多糖提取方法 香椿子適當粉碎，95％乙醇脫脂處理，過濾后晾干備用。取脫脂香椿子適量，精密稱定，加水回流提取，抽濾后減壓濃縮。濃縮液采用sevage法脫蛋白處理[9]，向脫蛋白溶液中加乙醇使含量達85％，4 ℃靜置過夜，抽濾，無水乙醇洗滌3次，干燥后即得香椿子多糖。

2.3.2 正交試驗設計及結果 以香椿子粗多糖含量為指標，選擇提取次數、提取時間、料液比三因素三水平進行正交試驗，運用正交表L9（34），優選香椿子多糖提取工藝條件，因素與水平見表1，正交試驗安排及結果見表2，方差分析見表3。

表1　水提工藝正交試驗因素水平表

表2　L9（34）正交試驗安排與結果

表3　正交試驗方差分析

由表2可知，以多糖含量為指標，各因素作用主次順序為A＞B＞C，其中因素A有顯著影響（P＜0.05），因素B、C無顯著影響（P＞0.05），所以優化的香椿子多糖提取方案為A3B3C3，即提取3次，提取120 min，料液比為1∶12。

2.3.3 驗證試驗 根據正交試驗得出的最佳組合條件，取同一批香椿子3份，按A3B3C3進行提取。香椿子多糖平均含量為18.54 mg，RSD＝2.92％（n＝3），說明方案穩定，最終確定較優方案為A3B3C3。

2.4 香椿子多糖體外抗氧化活性測定

2.4.1 試液配制 精密稱取香椿子多糖適量，加水定容于50 mL容量瓶中，制成5 mg/mL母液備用；精密移取多糖母液適量于10 mL容量瓶，定容，搖勻，即得系列濃度的多糖溶液。

精密稱取維生素C（Vc）適量，加水溶解，制成0.2 mg/mL溶液；精密移取Vc母液適量于10 mL容量瓶，定容，搖勻，即得不同濃度Vc溶液。

2.4.2 香椿子多糖總還原力測定 采用普魯士藍法[10]測定香椿子多糖總還原力。分別移取不同濃度Vc溶液與香椿子多糖1.0 mL于10 mL離心管中，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖溶液2.5 mL和1％鐵氰化鉀溶液2.5 mL混勻，50 ℃水浴保溫20 min，加入10％三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，3000 r/min離心10 min，精密移取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL和0.1 ％三氯化鐵0.5 mL，靜置10 min，于700 nm處測定吸光度，以蒸餾水為參比，測定3次，結果見圖1、圖2。

圖1　Vc總還原力測定結果

圖2　香椿子多糖總還原力測定結果

由圖1可知，Vc總還原力隨濃度增加而增加，在0.02～0.20 mg/mL范圍內呈線性關系，回歸方程為Y＝5.410 5X＋0.003 71，r＝0.999 6；可知，當Vc＝0.091 mg/mL時，吸光度為0.50，總還原力達到50％。

由圖2可知，香椿子多糖具有一定還原力，總還原力隨多糖濃度增加而增加，呈劑量依賴關系，在0.2～1.6 mg/mL范圍內有良好線性關系，回歸方程為Y＝0.483 8X＋0.020 2，r＝0.999 5。當香椿子多糖總還原力為50 ％時，多糖濃度為0.991 mg/mL。

2.4.3 香椿子多糖DPPH自由基清除率測定 參照文獻[11-13]，精密移取2.0 mL不同濃度香椿子多糖溶液和Vc溶液于試管中，加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液混勻，暗處反應30 min，517 nm處測定吸光度（Ai），同時測定2.0 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL）與等體積蒸餾水混合溶液的吸光度（A0），不同濃度香椿子多糖溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度（Aj），以Vc作為陽性對照，平行測定3次，取平均值。根據公式DPPH?清除率（％）＝（A0－Ai＋Aj）÷ A0×100％計算。結果見圖3、圖4。可見，在一定濃度范圍內，香椿子多糖對DPPH?有一定清除能力；清除能力隨多糖濃度增加而增加，但低于Vc對DPPH?的清除能力。

圖3　Vc對DPPH·清除作用測定結果

圖4　香椿子多糖對DPPH·清除作用測定結果

在0.002～0.007 mg/mL范圍內，根據Vc清除率，利用Excel2010軟件對曲線進行擬合，得方程Y＝0.005 58e385.03X，r＝0.998 7，可知Vc對DPPH?的IC50為0.005 7 mg/mL；在0.2～1.6 mg/mL范圍內，根據香椿子多糖清除率，同法擬合方程Y＝0.326 8lnX＋0.779 4，r＝0.986 0，可知香椿子多糖對DPPH?的IC50為0.43 mg/mL。

3 小結

本研究以多糖含量為指標，采用正交設計優化香椿子多糖提取工藝，初步建立了香椿子多糖制備方法，為后續香椿子多糖進一步分離純化及活性評價奠定了研究基礎。

香椿子多糖有一定抗氧化活性，本研究初步建立了數學模型，可為從中尋找新的清除體內自由基的抗氧化劑提供理論依據。

香椿子多糖具有抗氧化生物活性，本研究尚未對其進行分離純化及理化性質分析，香椿子多糖構效與量效關系有待于進一步研究。

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Study of Extraction Process of Polysaccharide from Seeds of Toona sinensis and Antioxidant

Activity in Vitro

DING Shi-hong1, LIU Bing1, ZHAO Shu-wei2, LI Yi-qing1, LI Wan-zhong1(1. Weifang

Medical University, Weifang 261053, China; 2. Changle County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Weifang 262400, China)

Objective To optimize the conditions of extraction process of polysaccharides from seeds of Toona sinensis; To preliminary determinate the antioxidant activity in vitro. Methods The content of polysaccharides from Toona sinensis was chosen as evaluation index; the extraction time, material liquid ratio, and extraction times were chosen as factors; L9(34) orthogonal design was used to optimize extraction process; antioxidant activity of polysaccharides from Toona sinensis was investigated by the total reducing power and 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) method. Results From the statistical data of processing, the optimal extracting conditions were as follows: liquid to material was 1:12, extraction time was 120 min, and extracted for 3 times. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis had certain reducing capacity and had better scavenging ability on DPPH? and the scavenging rate significantly increased with the concentration. The effect was simulated by curve equation. Conclusion The process is simple, feasible, stable and reliable and can be used for the small-scale study on extraction of polysaccharides from seeds of Toona sinensis. Polysaccharides from seeds of Toona sinensis have antioxidant activity.

polysaccharides from seeds of Toona sinensis; extraction process; antioxidation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.025

R284.2

A

1005-5304(2016)03-0091-04

國家自然科學基金面上項目（81274049）

李萬忠，E-mail：lwzwfmc@163.com

（2015-05-08）

（2015-06-02；編輯：陳靜）