夾竹桃內生真菌J14次生代謝產物的分離和抑菌活性

苗 智， 馬養民， 孔 陽， 許 倩， 屈子睿

(陜西科技大學 教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室， 陜西 西安 710021)

夾竹桃內生真菌J14次生代謝產物的分離和抑菌活性

苗 智， 馬養民*， 孔 陽， 許 倩， 屈子睿

(陜西科技大學 教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室， 陜西 西安 710021)

為進一步開發、利用和保護夾竹桃植物資源，對從秦嶺山區夾竹桃莖中分離得到活性較高的內生真菌J14進行鑒定，并對其次生代謝產物的化學成分進行研究。采用形態學特征和ITS序列分析對菌株J14進行鑒定，利用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、重結晶等方法對該菌株的發酵產物進行分離、純化，根據化合物的理化性質和1H-NMR、13C-NMR數據鑒定其結構，利用金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、煙草枯萎病菌、白菜黑斑病菌對所得化合物進行抑菌活性測試。結果表明：經形態學特征和ITS序列分析，鑒定菌株J14為鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)。從其發酵產物中分離得到8個化合物，分別鑒定為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)和甘露醇(8)。化合物3、4、5、6、7首次從鏈格孢屬真菌發酵產物中得到。化合物1對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.95 μg/mL，對番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度為3.91 μg/mL。

內生真菌； 夾竹桃； 鏈格孢屬； 次生代謝產物； 抑菌活性

內生真菌是指生活史的全部階段或者某一階段生活在植物組織內，對植物組織沒有造成明顯病害的真菌[1]。研究表明，植物內生真菌能夠產生多種次生代謝產物，具有促進植物生長[2]、抗菌[3-4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6-8]等作用。利用植物內生真菌代替宿主植物生產活性成分，可以增加藥物來源、緩解植物資源短缺的壓力等。因此，研究植物內生真菌中的活性成分具有十分重要的意義。

夾竹桃(Neriumindicum)屬于夾竹桃科夾竹桃屬植物[9]。原產印度、伊朗等東南亞地區，在我國栽培歷史悠久，遍及南北城鄉各地。主要功能為祛痰定喘、強心利尿、祛瘀、鎮痛。現代臨床醫學運用該藥治療跌打損傷、心力衰竭、癲癇、喘息咳嗽、斑禿、經閉[10]。目前，國內外對夾竹桃的研究報道多集中于其植物化學成分上的研究，對其內生真菌代謝產物的研究報道甚少。為了節約和保護夾竹桃植物資源，增加和發現藥物來源，筆者對夾竹桃內生真菌展開研究，以夾竹桃莖中分離得到的真菌鏈格孢霉(編號為J14)為研究對象，對其進行固態發酵，從其發酵產物中分離得到8個化合物，并對所得化合物進行抑菌活性測試，以期為進一步開發和利用夾竹桃內生真菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 夾竹桃內生真菌 從秦嶺地區的夾竹桃莖中分離得到菌株J14，在4 ℃下用PDA斜面培養基保存于實驗室。

1.1.2 測試菌 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Enterococcuscoli)，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)。植物病原菌真菌：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，煙草枯萎病菌(Tobaccowiltpathogens)，白菜黑斑病菌(Cabbageshadinggerms)。以上測試菌均保存于實驗室。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基：20%馬鈴薯浸汁 1000 mL，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，自然pH；察氏液體培養基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1000 mL，自然pH；牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，H2O 1000 mL，pH 7.2。以上所用試劑均為國產分析純試劑。

1.1.4 儀器 YX280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)，SW-CJ-1FD 超凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，HZQ-Q 全溫數顯振蕩器(金壇市瑞華儀器廠)，DH5000B 電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，柱色譜硅膠200 ～ 300 目(青島海洋化工廠分廠)，薄層色譜硅膠G(青島海浪硅膠干燥劑廠)，柱色譜凝膠Sephadex LH-20(上海浩然生物技術有限公司)，RE52CS-1 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，BS224S 電子天平(北京賽多利斯科學儀器系統有限公司)，XT-5 顯微熔點測定儀(未校準，北京市科儀電光儀器廠)，Bruker avance Ⅲ-400 Hz 超導核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，其余試劑均為國產分析純。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 形態學鑒定 將菌株J14接種于PDA培養基上，在28℃下培養5 d，觀察記錄菌落生長狀態，并用顯微鏡觀察孢子及分生孢子梗的形態等特征，以此作為依據進行鑒定[11]。

1.2.2 分子生物學鑒定 將菌株J14接種于PDA斜面培養基，在28℃下培養3 d至孢子成熟，利用CTAB法提取菌絲體基因組DNA。以提取到的基因組DNA為模板，通過引物ITS1和ITS4擴增目標菌株的18S rDNA的ITS區[12]。將測序獲得的ITS序列通過BLAST比對，根據同源性相似度差異，利用Clustal X軟件進行多序列匹配排列，采用軟件MEGA 5.0(鄰接法NJ)構建系統發育進化樹，對菌株J14與數據庫中登陸的近源菌株系統發育進化樹關系進行分析。

1.3 固態發酵和代謝產物的分離

1.3.1 固態發酵 菌株J14經過活化后，從PDA培養基上用打孔器制成直徑為6 mm的菌餅，按照1個菌餅接種于100 mL察氏液體培養基的比例，在28℃，120 r/min 振蕩培養5 d制備成種子培養液。在發酵瓶(480 mL)中加入大米50 g，無糖察氏培養基60 mL，在121℃下滅菌25 min，然后按照10%的接種量將種子液接種于上述培養基中，在28℃下靜置培養25 d[13]。

1.3.2 代謝產物的分離 將粉碎、陰干的發酵產物用乙酸乙酯提取，提取液經減壓蒸餾得到浸膏460 g。采用硅膠柱色譜對浸膏進行分離，以石油醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、甲醇為溶劑進行梯度洗脫，得到4個部分(Fr.1 ～ 4)。對Fr.2(96.93 g)以石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、甲醇為溶劑進行洗脫，經過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經過重結晶純化，分別得到化合物1(75 mg)、化合物2(108 mg)、化合物3(30 mg)、化合物4(145 mg)、化合物5(90 mg)、化合物6(30 mg)、化合物7(88 mg)。對Fr.3(133.83 g)的洗脫液進一步分離得到化合物8(1.81 g)。所有化合物經過1H-NMR和13C-NMR分析確定其結構。

1.4 抑菌活性測試

根據最小抑菌濃度法，將待測化合物溶解于DMSO溶劑中，配成質量濃度為1 mg/mL的溶液。將牛肉膏蛋白胨液體培養基或PDA培養基(不加瓊脂)，按每孔100 μL加入到96孔板中，再向第1個孔中加入上述樣品溶液100 μL混合均勻，再從第1孔中吸取100 μL于第2孔中混合均勻，再從第2孔中吸取100 μL于第3孔中混合均勻，連續稀釋至第10孔，從第10孔中取出100 μL棄去，第11孔和第12孔分別留作牛肉膏蛋白胨液體培養基和DMSO溶劑陰性對照。第1 ～ 10孔中化合物的質量濃度依次為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.3 μg/mL、15.6 μg/mL、7.81 μg/mL、3.91 μg/mL、1.95 μg/mL和0.98 μg/mL。用無菌水將斜面培養基上生長良好的指示菌沖洗下來，用牛肉膏蛋白胨液體培養基或PDA培養基(不加瓊脂)配制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，向每孔中加入100 μL指示菌菌懸液。選用青霉素鈉作為革蘭氏陽性菌的陽性對照，硫酸鏈霉素作為革蘭氏陰性菌的陽性對照，酮康唑作為植物病原菌真菌的陽性對照。上述每組進行3次平行試驗。將細菌試驗組的96孔板置于37 ℃培養24 h、植物病原菌真菌試驗組的96孔板置于28℃培養48 h后觀察并記錄結果[14]。

該序列與鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)的ITS序列(序列號為KM250374.1)同源性為99%，綜合形態學特征和ITS序列分析基礎上的菌株J14系統發育進化樹分析(圖2)將菌株J14鑒定為鏈格孢霉。

2 結果與分析

2.1 菌株J14的鑒定

菌株J14形態初期為白色，隨后變墨綠色，后期為黑色，菌落呈絨毛狀，培養基背面無染色；顯微鏡下能夠明顯觀察到菌絲呈暗至黑色，有隔膜，分生孢子梗較短，分生孢子呈紡錘狀或倒棒狀，頂端延長成喙狀，一般為褐色，且孢子密集易散落，因此初步確定菌株J14為鏈格孢屬真菌(圖1)。經PCR擴增后獲得的菌株J14的ITS序列長1315 bp(GenBank中的序列號為KP003986.1，基因序列為：

該序列與鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)的ITS序列(序列號為KM250374.1)同源性為99%，綜合形態學特征和ITS序列分析基礎上的菌株J14系統發育進化樹分析(圖2)將菌株J14鑒定為鏈格孢霉。

圖1 夾竹桃內生真菌J14的形態學特征

Fig.1 Morphological features of the fungus strain J14 ofN.indicum

圖2 基于ITS序列基礎上的夾竹桃內生真菌J14 系統發育進化樹

Fig.2 Phylogenetic tree of the fungus strain J14 ofN.indicumbased on ITS sequence

圖3 8種夾竹桃內生真菌J14次生代謝化合物的化 學結構

Fig.3 Chemical structures of the eight compounds isolated from the fungus strain J14 ofN.indicum

2.2 代謝產物結構鑒定

從菌株J14固體發酵產物中分離得到8個化合物，分別為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)、甘露醇(8)。其結構式見圖3。

化合物1：淡紫色粉末(甲醇)，mp 277 ～ 278℃。

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.84 (s, 1H, 7-OH), 10.40 (s, 1H, 3-OH), 7.24 (d, J= 1.7 Hz, 1H, 10-H), 6.74 (d, J= 2.2 Hz, 1H, 2-H), 6.66 (d, J= 2.4 Hz, 1H, 4-H), 6.63 (d, J=1.9 Hz, 1H, 8-H), 3.92 (s, 3H, 9-OCH3), 2.74 (s, 3H, 1-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：166.13 (6-C), 164.66 (9-C), 164.10 (7-C), 158.54 (3-C), 152.60 (4a-C), 138.44 (1-C), 137.75 (10a-C), 117.57 (2-C), 108.77 (10b-C), 103.39 (10-C), 101.59 (4-C), 99.15 (8-C), 98.44 (6a-C), 55.81 (9-OCH3), 25.00 (1-CH3)。經與文獻[15]對照核磁數據，確定化合物1為交鏈孢甲醚(alternariol methyl ether)。

化合物2：白色粉末(甲醇)，mp 320 ～ 321℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.78 (s, 1H, 7-OH), 10.91 (s, 1H, 9-OH), 10.34 (s, 1H, 3-OH), 7.25 (d,J= 1.2 Hz, 1H, 10-H), 6.72 (d,J= 2.1 Hz, 1H, 2-H), 6.64 (d,J= 2.3 Hz, 1H, 4-H), 6.37 (d, J= 1.5 Hz, 1H, 8-H), 2.71 (s, 3H, 1-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：165.36 (6-C), 164.65 (9-C), 164.01 (7-C), 158.37 (3-C), 152.57 (4a-C), 138.29 (1-C), 138.07 (10a-C), 117.47 (2-C), 108.90 (10b-C), 104.25 (10-C),101.55 (4-C), 100.81 (8-C), 97.35 (6a-C), 25.22 (1-CH3)。經與文獻[16]對照核磁數據，確定化合物2為交鏈孢酚(alternariol)。

化合物3：白色晶體(甲醇)，mp > 350℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：8.88 (d,J= 3.9 Hz, 1H, 18-NH), 8.63 (d,J= 6.7 Hz, 1H, 12-NH), 8.00 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-NH), 7.40 (d, J= 9.2 Hz, 1H, 6-NH), 7.12 (d,J= 11.0 Hz, 1H, 21-NH), 4.73 (td,J= 10.9, 4.4 Hz, 1H, 21-H), 4.48 (td,J= 9.2, 6.3 Hz, 1H, 6-H), 4.00 (d,J= 3.5 Hz, 1H, 1-H), 3.97 - 3.91 (m, 1H, 18-H), 3.88 (dd, J= 10.4, 6.8 Hz, 1H, 12-H), 3.52 (dd, J= 14.9, 3.1 Hz, 1H, 19-Hb), 3.27 - 3.22 (m, 1H, 22-Hb), 3.18 (m, 2H, 19,22-Ha), 2.05 (m, 1H, 2-H), 1.71 (m, 1H, 13-H), 1.62 - 1.49 (m, 2H, 8-H, 14-Hb), 1.42 (m, 1H, 7-Hb), 1.38 - 1.29 (m, 1H, 7-Ha), 1.19 -1.10 (m, 1H, 14-Ha), 0.90 (d,J= 6.6 Hz, 3H, 9-H), 0.87 (d,J= 6.6 Hz, 3H, 10-H), 0.83 (d,J= 6.9 Hz, 9H, 3,4,15-H), 0.79 (d,J= 6.8 Hz, 3H, 16-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：173.96 (20-C), 172.98 (11-C), 172.74 (17-C), 170.53 (5-C), 169.71 (23-C), 58.77 (1-C), 57.97 (12-C), 52.87 (21-C), 52.35 (18-C), 50.31 (6-C), 46.18 (19-C), 45.16 (22-C), 40.82 (7-C), 33.97 (13-C), 26.81 (2-C), 24.70 (14-C), 24.44 (8-C), 22.67 (9-C), 21.73 (10-C), 19.64 (3-C), 18.65 (4-C), 14.88 (16-C), 9.94 (15-C)。經與文獻[17]對照核磁數據，確定化合物3為malformin A1。

化合物4：白色粉末(甲醇)，mp 310 ～ 312℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.04 (s, 1H, 3-H), 10.62 (s, 1H, 1-H), 7.26 (d,J= 5.3 Hz, 1H, 6-H), 1.72 (s, 3H, 5-CH3)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：164.90 (4-C), 151.46 (2-C), 137.70 (6-C), 107.62 (5-C), 11.79 (7-C)。經與文獻[18]對照核磁數據，確定化合物4為胸腺嘧啶(thymine)。

化合物5：白色粉末(甲醇)，mp 335 ～ 337℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：11.04 (s, 1H, 3-H), 10.84 (s, 1H, 1-H), 7.40 (dd, J= 7.5, 5.9 Hz, 1H, 6-H), 5.45 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 5-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：164.31 (4-C), 151.49 (2-C), 142.18 (6-C), 100.18 (5-C)。經與文獻[19]對照核磁數據，確定化合物5為尿嘧啶(uracil)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，mp > 350℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：13.34 (s, 1H, 7-H), 11.54 (s, 1H, 1-H), 10.86 (s, 1H, 3-H), 7.94 (s, 1H, 8-H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：155.43 (6-C), 151.35 (2-C), 148.94 (4-C), 140.62 (8-C), 106.50 (5-C)。經與文獻[20]對照核磁數據，確定化合物6為黃嘌呤(xanthine)。

化合物7：白色晶體(甲醇)，mp 125 ～ 126℃。1H-NMR (400 MHz, D2O) δ：3.63 (dd,J= 11.1, 1.5 Hz, 2H, 2,3-H), 3.50 (m, 4H, 1,4-H)。13C-NMR (100 MHz, D2O) δ：71.30 (2,3-C), 62.01 (1,4-C)。經與文獻[21]對照核磁數據，確定化合物7為赤蘚醇(erythritol)。

化合物8：白色晶體(甲醇)，mp 167 ～ 169℃。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：4.44 (d,J= 5.1 Hz, 2H, 3,4-OH), 4.36 (t,J= 4.9 Hz, 2H, 1,6-OH), 4.16 (d,J= 7.0 Hz, 2H, 2,5-OH), 3.61 (m, 2H), 3.54 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 3.45 (m,2H), 3.37 (m,2H)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ：71.24 (2,5-C), 69.58 (3,4-C), 63.82 (1,6-C)。經與文獻[22]對照核磁數據，確定化合物8為甘露醇(mannitol)。

2.3 化合物的抑菌活性

利用金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、煙草枯萎病菌、白菜黑斑病菌對所得8個化合物進行抑菌活性測試可知(表)，設置的牛肉膏蛋白胨液體培養基或PDA培養基(不加瓊脂)和DMSO溶劑陰性對照組中測試菌株均正常生長。

表 8種夾竹桃內生真菌J14次生代謝化合物的最小抑菌濃度

注：青霉素鈉作為陽性菌的陽性對照，硫酸鏈霉素作為陰性菌的陽性對照，酮康唑作為植物病原菌真菌的陽性對照，-為未設置試驗。

Note: Penicillin sodium, streptomycin sulfate and ketoconazole are used as positive CK, negative CK and plant pathogens fungus respectively. - means that the experiments are not set.

從表可知，化合物 1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)對金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌均有良好的抑菌活性，其活性和陽性對照結果相當。其中，化合物1對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.95 μg/mL，對番茄灰霉病菌的最小抑菌濃度為3.91 μg/mL，皆優于陽性對照。

3 結論與展望

從夾竹桃莖中分離得到的內生真菌J14，經形態學特征和ITS序列分析，鑒定其為鏈格孢霉(Alternariasp. SPS-04)，從其發酵產物中分離得到8個化合物，分別為交鏈孢甲醚(1)、交鏈孢酚(2)、malformin A1(3)、胸腺嘧啶(4)、尿嘧啶(5)、黃嘌呤(6)、赤蘚醇(7)和甘露醇(8)。由此說明，夾竹桃內生真菌的次生代謝產物繁多。化合物 1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)對金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌的抑菌活性良好。因此，化合物 1(交鏈孢甲醚)和化合物 2(交鏈孢酚)可成為良好的抗菌藥物。

基于此研究，鏈格孢霉菌為抗菌藥物提供了新的來源。筆者將繼續對夾竹桃內生真菌J14(鏈格孢霉)的次生代謝產物進行研究，以期得到抑菌效果更好或者結構新穎的化合物。此外，還將對夾竹桃其他部位的內生真菌進行分離，并篩選活性較強的一系列內生真菌，對其次生代謝產物進行系統的研究，從而進一步開發和利用夾竹桃內生真菌。

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(責任編輯： 孫小嵐)

Isolation and Secondary metobalities Antibucterial activity of J14,An Endophytic Fungus inNeriumindicum

MIAO Zhi， MA Yangmin*， KONG Yang， XU Qian， QU Zirui

(KeyLaboratoryofAuxiliaryChemistry&TechnologyforChemicalIndustry,MinistryofEducation,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology,Xi’an，Shaanxi710021,China)

To exploit and protect resources ofN.indicum, the fungus strain J14 which was isolated fromN.indicumin Qinling Mountain with higher antimicrobial activities was identified and secondary metobalities of J14 was studued. The strain J14 was identified according to its morphological characteristics and ITS sequence. The secondary metabolities from J14 were isolated by silica gel column, Sephadex LH-20 column chromatography, recrystallization, and so on. Their structures were determined by their physicochemical properties, 1H-NMR and 13C-NMR data. Antimicrobial activities of all compounds were tested againstStaphylococcusaureus,Streptococcuslactis,Enterococcuscoli,Pseudomonasaeruginosa,Fusariumgraminearum,Botrytiscinerea,Tobaccowiltpathogens,Cabbageshadinggerms. Results: The strain J14 was defined asAlternariasp. SPS-04. Eight compounds from fermentation of J14 were identified as alternariol methyl ether(1), alternariol(2), malformin A1(3), thymine(4), uracil(5), xanthine(6), erythritol(7) and mannitol(8). Compounds 3,4,5,6,7 were firstly obtained from fermentation of the genusAlternaria. Compounds 1 showed a MIC value of 1.95 μg/mL againstS.aureusand showed a MIC value of 3.91 μg/mL againstB.cinerea.

endophytic fungus;Neriumindicum;Alternariasp.; secondary metabolites; antimicrobial activities

2015-05-21； 2015-12-03修回

高等學校博士學科點專項科研基金項目“藥用植物內生真菌中抗菌活性代謝產物研究”(20116125110001)；陜西省自然科學基礎研究計劃項目“植物內生真菌溜曲霉中吲哚二酮哌嗪類代謝產物的研究”(2014JZ003)；陜西省教育廳自然科學專項項目“蝙蝠葛莖葉抗植物病原菌活性物質基礎的研究”(2013JK0726)

苗 智(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：天然產物化學。E-mail：pokemon001@126.com

*通訊作者:馬養民(1963-)，男，教授，博士生導師，從事天然產物化學研究。E-mail：mym63@sina.com

1001-3601(2016)01-0024-0088-05

R932； O629

A