野木瓜多糖對肝損傷大鼠的保護作用

陳雪梅

(遵義醫學院附屬醫院兒科，貴州　遵義　563003)

?

野木瓜多糖對肝損傷大鼠的保護作用

陳雪梅

(遵義醫學院附屬醫院兒科，貴州遵義563003)

〔摘要〕目的研究木瓜多糖對實驗性肝損傷大鼠的保護作用及機制。方法采用四氯化碳誘導大鼠肝損傷,全自動生化分析儀分別檢測血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(GPT)及谷草轉氨酶(GOT)；采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法檢測血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，應用Real-time PCR檢測各組肝臟組織中轉化生長因子(TGF)-β1的表達。結果木瓜多糖組血清TP、ALB較模型組顯著增高，GPT、GOT活性顯著降低；血清中SOD的活性均明顯增高、MDA含量也顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；與模型組相比，木瓜多糖組能夠使大鼠肝臟內的TGF-β1 mRNA表達下降(P<0.05)。結論木瓜多糖的抗氧化作用及降低TGF-β1的表達可能是其對實驗性肝損傷的保護機制之一。

〔關鍵詞〕野木瓜多糖；肝損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；轉化生長因子-β1

第一作者：陳雪梅(1974-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事小兒內科臨床研究。

野木瓜為薔薇科木瓜屬植物，具有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗腫瘤等作用，野木瓜富含有機酸、氨基酸、蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質等多種元素和營養物質外，還含有多糖、皂苷、黃酮、果膠等化合物，是一種食藥兩用的珍貴天然植物〔1~3〕。目前木瓜多糖對肝臟的保護作用研究較少，本實驗觀察木瓜多糖對大鼠肝損傷中血清酶、蛋白合成能力的影響,探討木瓜多糖對肝損傷的保護作用及可能機制。

1材料和方法

1.1材料 野木瓜購于貴州省遵義市正安縣；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，四氯化碳(CCl4)(國藥集團分析純，批號20120125)；聯苯雙酯(浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號120116)；其余試劑為國產分析純。721紫外-可見分光光度計(上海光電研究所)；BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士)。

1.2野木瓜多糖的制備野木瓜構于遵義市藥材公司，采用水提醇沉法提?。喝?00 g野木瓜粉碎成粗粉，加入5 000 ml蒸餾水后加熱提取3 h，紗布過濾后合并濾液，10 000 r/min離心20 min，然后采用BUCHI旋轉蒸發儀濃縮至250 ml濃縮液。加入終濃度為80%的乙醇沉淀，靜置24 h后，離心取沉淀。再將沉淀用蒸餾水溶解，用Seveage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)脫蛋白數次后，進行24 h透析，其中流水透析12 h，蒸餾水靜置12 h，取透析液濃縮后，冷凍干燥得到野木瓜多糖〔4~7〕。

1.3大鼠肝損傷模型的制備選用清潔級SD雄性大鼠〔購自第三軍醫大學動物實驗中心，動物編號：SCXK(渝)2011-0005〕，10~12周齡，體重為150~180 g，模型組按3 ml/kg(CCl4與橄欖油按2∶3比例混合，3 ml/kg)皮下注射40%CCl4，對照組按3 ml/kg皮下注射橄欖油，每周2次，首劑加倍，連續注射4 w〔8~11〕。

1.4實驗分組實驗分六組，每組10只雄性大鼠：①正常組；②模型組：SD大鼠以3 ml/kg皮下注射40%CCl4，連續注射4 w；③陽性對照組：以聯苯雙酯100 mg·kg-1·d-1灌胃，連續4 w；④木瓜多糖組：大鼠實驗性肝損傷模型+不同劑量野木瓜多糖灌胃(低、中、高劑量組分別以濃度為40、80、160 mg/kg野木瓜)，每天一次共4 w〔7〕。

1.5血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)的測定于腹腔動脈取血，離心分離血清，利用全自動生化分析儀進行測定。

1.6SOD和MDA表達的測定按照試劑盒說明書測定各組血清SOD和MDA的水平。

1.7Real-time PCR測定肝臟中TGF-β1 mRNA表達大鼠肝臟總RNA采用Trizol法提取，然后采用實時定量-逆轉錄聚合酶鏈反應進行基因片段擴增并定量。大鼠TGF-β1及內參基因(β-actin)引物如下：TGF-β1上游引物為5'-atacgcctgagtggctgtct-3'，下游引物為5'- ttgggactgatcccattgat-3'；β-actin上游引物為5'-gtagccatccaggctgtgtt-3'，下游引物為5'-accctcatagatgggcacag-3'。反應條件：①Real-time PCR：95℃，5 s，59℃，20 s，72℃，20 s，40個循環。②溶解曲線：95℃，5 s，65℃，5 s，60個循環。PCR反應各管所加模板RNA的量約為1 μg。最終通過Real-time PCR儀記錄的Ct值而對起始模板相對定量。

1.8統計學方法應用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較應用SNK-q檢驗。

2結果

2.1TP、ALB、GPT、GOT的測定木瓜多糖組大鼠血清TP和ALB明顯高于模型組，GPT和GOT水平明顯低于模型組(P<0.05)，并且呈劑量依賴性；野木瓜多糖高劑量組大鼠血清中TP，ALB，GPT和GOT水平與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1　野木瓜對大鼠血清TP、ALB、GPT、

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.2SOD和MDA表達的測定木瓜多糖組大鼠血清中SOD明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，并且呈劑量依賴性；木瓜多糖高劑量組大鼠血清中SOD和 MDA水平與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2　野木瓜對大鼠血清中SOD和MDA

2.3Real-time PCR測定肝臟中TGF-β1 mRNA表達模型組TGF-β1 mRNA的表達高于正常組(206.47±9.14 vs 38.25±2.09，P<0.05)，木瓜多糖低、中、高劑量組中TGF-β1 mRNA明顯低于模型組(136.85±8.31、97.96±4.61、58.42±4.87，P<0.05)。陽性對照組(54.31±3.28)與木瓜多糖高劑量組無顯著差異(P>0.05)。

3討論

肝臟是人體內最大的實質性腺體，是體內新陳代謝的中心站。肝損傷是肝臟最常見的病理過程，由此引起的肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化及肝腫瘤等嚴重危害人類的健康，因此對肝臟損傷的藥物研究具有重要意義。

木瓜為薔薇科木瓜屬，是一種營養豐富的藥食兩用的“果之珍品”，中醫認為木瓜有舒筋活絡、健脾開胃，舒肝止痛，祛風除濕之效；能治療腰膝疼痛、腳氣水腫、痢疾霍亂、心痛腹痛等疾病。另外，木瓜還有抗菌消炎、護肝降酶、清暑利尿、解酒祛痰等作用。對于木瓜化學成分的研究表明，其中含有蘋果酸、枸櫞酸、酒石酸、抗壞血酸等多種有機酸以及苷類、黃酮、氨基酸、鞣質等成分，但對木瓜多糖的研究則鮮見報道。

CCl4可使大鼠體內產生大量的自由基，而肝臟極易受到自由基的侵害而發病，造成肝損傷。CCl4肝損傷模型是經典的化學性肝損傷動物模型，CCl4模型中CCl4在肝微粒體細胞色素P-450激活下生成CCl3·自由基，這些自由基可與肝細胞內大分了發生其價結合，也可攻擊膜不飽和脂質，引起脂質過氧化，使肝細胞損傷，轉氨酶從受損的肝細胞內溢出，使血清中轉氨酶升高。MDA是脂質過氧化的主要降解產物，可進一步損傷肝細胞的結構，導致肝細胞壞死，其含量的大小可以間接反映自由基對組織的破壞程度。MDA通常和SOD聯合使用，一起反映氧自由基對細胞的損傷程度。本實驗說明木瓜多糖能夠改善CCl4引起的肝功能損傷。

TGF-β1是被公認為與肝纖維化發生關系最為密切的細胞因子，不僅促進成纖維細胞的增殖及分化，促進膠原蛋白等細胞外基質成分的基因轉錄及蛋白合成 通過抑制蛋白酶的合成來阻止基質蛋白的降解．而且可誘導巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞參與炎性反應〔12，13〕。本實驗結果顯示木瓜多糖能過明顯降低模型組中TGF-β1 mRNA的表達。

綜上，木瓜多糖能夠改善CCl4所致的肝臟損傷，其機制可能與其增加自由基清除酶活力，清除輻射過程中脂質過氧化物的形成及降低TGF-β1 mRNA 的表達有關，為野木瓜的食用藥用研究提供了新的實驗依據。

4參考文獻

1張毅，王少敏．木瓜高效栽培與利用〔M〕．北京：中國農業出版社，2003：1-2．

2陳瑛,李錦,吳英良.野木瓜化學成分及其藥理和臨床研究進展〔J〕.沈陽藥科大學學報,2008;25(11):924-7.

3孫帥,謝培山.野木瓜的研究進展〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2011;22(6):696-700.

4Ozercan IH,Dagli AF,Ustundag B,etal.Does instant coffee prevent acute liver injury induced by carbon tetrachloride CCl(4)〔J〕.Hepatol Res,2006；35(3):163-8.

5Sahreen S,Khan MR,Khan RA.Ameliorating effect of various fractions of rumex hastatus roots against hepato- and testicular toxicity caused by CCl4〔J〕.Oxid Med Cell Longev,2013;2013:325406.

6Nurrochmad A,Margono SA,Sardjiman A,etal.Hepatoprotective and antioxidant activity of pentagamavunon-O against carbon tetrachloride-induced hepatic injury in rats〔J〕.Asian Pac J Trop Med,2013;6(6):438-42.

7楊子安，儲繼凱，邵崇波,等.硒酵母對大鼠慢性肝纖維化的治療作用〔J〕.中國老年學雜志,2010；30(21)：3138-40.

8王文平，郭祀遠，李琳,等.野木瓜水溶性多糖的提取、分離及結構分析〔J〕.華南理工大學學報(自然科學版),2008;36(7):128-34.

9Yang L,Qu H,Mao G,etal.Optimization of subcritical water extraction of polysaccharides from Grifola frondosa using response surface methodology〔J〕.Pharmacogn Mag,2013;9(34):120-9.

10Jin X,Ning Y.Extraction optimization and bioactivity of polysaccharides from Aspergillus fumigatus AF1〔J〕.Carbohydr Polym，2013;96(2):411-6.

11Ji YB,Dong F,Ma DB,etal.Optimizing the extraction of anti-tumor polysaccharides from the fruit of Capparis spionosa L.by response surface methodology〔J〕.Molecules,2012;17(6):7323-35.

12Wang YP,Yu GR,Lee MJ,etal.Lipocalin-2 negatively modulates the EMT in hepatocellular carcinoma through the EGF(TGF-beta1)/Lcn2/Twist1 pathway〔J〕.Hepatology,2013;58(4):1349-61.

13Jia D,Duan F,Peng P,etal.Up-regulation of RACK1 by TGF-β1 promotes hepatic fibrosis in mice〔J〕.PLoS One,2013;8(3):e60115.

〔2014-08-30修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕Q813.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0775-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.003