FOXC1蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

聶麗敏　王琳琳　劉　杰　高　薇　林文俐　喬　麗　孫玉萍

(泰山醫學院，山東　泰安　271016)

?

FOXC1蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

聶麗敏王琳琳劉杰高薇林文俐喬麗1孫玉萍

(泰山醫學院，山東泰安271016)

〔摘要〕目的探討FOXC1蛋白在食管鱗狀細胞癌(ESCC)中的表達及其與腫瘤的病理類型、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移等臨床病理特征之間的相關性。方法采用免疫組化法分別檢測FOXC1在94例ESCC組織及47例癌旁正常組織中的表達，并結合臨床病理學參數進行統計學分析。結果FOXC1蛋白陽性表達主要定位于ESCC細胞的胞質,少數同時定位于胞核；ESCC及癌旁正常組織中Foxc1陽性表達率有顯著差異(P=0.000)；FOXC1在ESCC低分化組(96.7%)、T3+T4期組(90.3%)及淋巴結陽性組(95.0%)的陽性表達率均明顯高于相應的中高分化組(75.0%)、T1+T2組(71.4%)和淋巴結陰性組(72.2%)，P值分別為0.011、0.018和0.005；而與性別、年齡等無明顯相關性(P均>0.05)。結論FOXC1的高表達可能在ESCC的發生發展及侵襲轉移過程中發揮重要作用。

〔關鍵詞〕FOXC1；食管鱗狀細胞癌；上皮間充質轉化

1山東大學附屬濟南市中心醫院腫瘤科

第一作者：聶麗敏(1984-)，女，碩士在讀，主要從事腫瘤基礎研究。

我國是世界上食管癌的高發國家，食管癌校正死亡率居世界首位〔1〕。然而，大部分食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者對現有的治療手段不敏感，疾病控制率低，患者難以獲得滿意的生活質量，總體生存期短。以往研究表明，FOXC1從上皮間充質轉化(EMT)、細胞信號轉導和血管內皮細胞形成等多方面影響腫瘤細胞的分裂、增殖和侵襲轉移能力，其高表達和腫瘤的發生發展及侵襲轉移關系密切〔2~6〕，但有關FOXC1在ESCC中表達的研究國內外仍尚未有報道。本研究探討FOXC1的表達在食管鱗癌發生發展過程中可能的作用機制及臨床意義。

1材料與方法

1.1標本的采集 收集濟南市中心醫院病理科2008年1月至2012年12月術后病理均診斷為ESCC的存檔組織蠟塊94例，患者均為首次手術,術前均未接受任何的化療、放療及生物靶向治療等治療，均有詳細的臨床資料。同時選取47例癌旁正常組織(距離癌組織5 cm 以上)，經病理證實均未見癌細胞。94例ESCC患者，男81例，女13例；年齡44~81歲，中位年齡為62歲；伴有淋巴結轉移者40例；TNM分期按2009年國際抗癌聯盟(UICC)修訂的標準：T1+T2期42例，T3+T4期52例；Ⅰ+Ⅱ期57例，Ⅲ+Ⅳ期37例；依據病理分化程度分為：高分化鱗癌15例，中分化鱗癌49例，低分化鱗癌30例。本研究獲得醫院倫理委員會批準，并遵循患者知情同意的原則。

1.2試劑試劑：羊抗兔FOXC1多克隆抗體購自英國Abcam公司，Max Vision兔抗羊多克隆抗體及DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物技術有限公司。其余常用免疫組化試劑略。

1.3檢測方法采用免疫組織化學法進行石蠟腫瘤組織抗原檢測。所有腫瘤組織標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，連續3~4 μm切片。切片烤片后常規脫蠟至水。抗原在EDTA中高壓修復2 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min，采用3%過氧化氫10 min阻斷內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗1次，3 min，PBS沖洗2次，每次3 min，滴加一抗(50 μl/張)，4℃孵育過夜，37℃復溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加Max Vision二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知的陽性組織作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結果判斷具有正高職稱的病理科醫師3名雙盲閱片，光鏡下每張切片隨機取20個高倍鏡(400倍)，記錄每個視野下1 000個細胞中陽性著色細胞數，計算陽性百分率后取其平均值。FOXC1蛋白陽性表現為胞質或胞核黃色或棕黃色顆粒，記錄陽性細胞比率：陽性細胞1%~30%計1分，30%~60%計2分，>60%計3分，細胞染色強度：0分為未著色，淺黃色為1分，黃色至棕黃色為2分，棕黃色為3分。然后記錄二者的乘積，<3分為低表達，≥3分為高表達，即陽性表達。

1.5統計學方法采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗。

2結果

2.1ESCC組織和癌旁正常組織FOXC1的表達情況ESCC組織中FOXC1蛋白表達主要位于腫瘤細胞質和部分細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒；癌旁正常對照組織中幾乎無FOXC1的表達，或僅在少數細胞核中有低水平的表達，呈淺黃色顆粒。見圖1。ESCC組織中FOXC1陽性表達率顯著高于正常對照組〔89.1%(77/94) vs 25.5%(12/47),χ2=42.791,P=0.000〕。

ESCC胞質陽性表達

ESCC胞質及胞核陽性表達

癌旁正常組織陽性表達

2.2FOXC1蛋白的表達與臨床病理參數間的相關性FOXC1在ESCC低分化組、T3+T4期組及淋巴結陽性組的陽性表達率均明顯高于相應的中高分化組、T1+T2組和淋巴結陰性組(P=0.011、0.018、0.005)；而與性別、年齡等無明顯相關性(P均>0.05)。見表1。

表1　FOXC1蛋白陽性表達與臨床病理參數的關系〔n(%)〕

3討論

轉錄因子是一類通過調控靶基因表達從而影響細胞、組織或器官的生長、發育、分化、代謝等一系列的生物學過程的關鍵性蛋白。叉頭框(FOX)轉錄因子是一類從酵母等低等生物到人類等高等真核生物中普遍存在的一種重要的轉錄因子，目前FOX轉錄因子超家族根據DNA結合區的同源性差異從A到S共分為19個亞族，100多個FOX家族成員。FOX轉錄因子的DNA結合區稱之為“叉頭區”由100個氨基酸組成，核心部分由3個α螺旋排列構成，兩側通過β鏈連接了兩個環狀結構。由于其空間結構特點，又被稱為翼狀螺旋蛋白〔7〕。FOX轉錄因子在生物體胚胎的生長發育、生物代謝、免疫調節等方面都發揮重要作用，其突變或表達異常與發育畸形、代謝性疾病、腫瘤、免疫異常等密切相關〔7〕。

FOXC1為FOX轉錄因子家族的一員，它的編碼基因位于人染色體6p25基因編碼區〔8〕，其基因突變或表達異常與動物胚胎發育異常、人類Axenfeld-Rieger 綜合征的發生密切相關〔9,10〕。在多種惡性腫瘤組織中，如乳腺癌、子宮內膜癌、原發性肝癌等，FOXC1的異常表達也被報道與腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移密切相關，是腫瘤患者預后差的標志〔2~6〕。本研究首次檢測分析了FOXC1在ESCC中的表達情況，結果發現FOXC1在ESCC組織中的表達明顯高于正常組織，并且與ESCC的分化程度、T分期及區域淋巴結轉移關系密切相關，分化程度越低、腫瘤負荷越大和有淋巴結轉移者表達更高，提示FOXC1高表達在ESCC的發生發展及侵襲轉移中可能發揮重要作用。

FOXC1被發現是腫瘤細胞EMT的重要調節因子〔4,11~13〕。EMT是指在轉錄因子Snail，Slug，Twist，Zeb1等作用下，細胞間黏附分子E-Cadherin丟失，基質金屬蛋白酶(MMPs)等表達增加，上皮性腫瘤細胞轉變為游走遷徙能力更強的間充質性細胞，從而使腫瘤細胞獲得更高的侵襲轉移能力。有研究發現：FOXC1在原發性肝細胞肝癌(HCC)中過表達不僅誘導轉錄因子Snail的表達上調促進EMT，而且誘導E-cadherin的表達下調，從而增強HCC的侵襲及遠處轉移；敲除FOXC1后，EMT會部分逆轉，細胞骨架發生重構，MMP1,MMP2,MMP7,MMP9和血管內皮生長因子-A(VEGF-A)的表達也隨之下調，最終導致HCC的增殖、侵襲及轉移能力均降低〔4,12〕。此外，研究證實緊密連接蛋白claudin呈低表達的乳腺癌中，FOXC1蛋白的過表達不但可獨立作為EMT的誘導劑，而且也可以上調EMT的轉錄因子Snail,Twist，TGF-β1等共同完成EMT的過程。由此可見，FOXC1的表達與Snail、MMPs等EMT促進因子的表達呈正相關而與E-cadherin等EMT抑制因子的表達呈負相關，FOXC1也因此被視為腫瘤細胞發生EMT的正性調控分子。在ESCC中，多項研究證實存在 EMT轉錄因子Slug,Twist,Snail的過表達，同時E-cadherin的表達降低，是患者的預后不佳的提示〔14，15〕。而MMPs的過表達也被發現與ESCC的EMT及血管生成密切相關，在ESCC發生發展及侵襲轉移過程中也發揮了重要作用〔16〕。推測FOXC1在ESCC中的表達也可能通過調節轉錄因子Snail、Slug、Twist，E-cadherin，MMPs或VEGF的表達而參與EMT,進而促進ESCC的發生發展及侵襲轉移，但是其中具體分子調節機制尚需研究進一步證實。

4參考文獻

1William PT,David PK,David HI.Targeted therapies for esophageal cancer〔J〕.Oncologist,2005;10(8):590-601.

2Chung TKH,Lau TS,Cheung TH,etal.Dysregulation of miroRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1〔J〕.Int J Cancer,2012;130:1036-45.

3Partha SR,Sanjay PB.Basal-like breast cancer defined by FOXC1 expression offers superior prognostic value:a retrospective immunohistochemical study 〔J〕.Ann Surg Oncol,2011;18:3839-47.

4Xu ZY,Ding SM,Zhou L.FOXC1 contributes to microvascular invasion in primary hepatocellular carcinoma via regulating epithelial-mesenchymal transition〔J〕 .Int J Biol Sci,2012;8(8):1130-41.

5Lei WF,Gu CY,Liu RJ,etal.High level of FOXC1 expression is associated with poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Tumour Biol J Int Soc Oncodev Biol Med,2012;34(2):853-8.

6Wei LX,Zhou RS,Xu HF,etal.High expression of FOXC1 is associated with poor clinical outcome in non-small cell lung cancer patients〔J〕.Tumour Biol J Int Soc Oncodev Biol Med,2013;34(2):941-6.

7Lam EW,Brosens JJ,Gomes AR.Forkhead box proteins:tuning forks for transcriptional harmony〔J〕.Nat Rev Cancer,2013;13:482-95.

8Lehmann OJ.Ocular developmental abnormalities and glaucoma associated with interstitial 6p25 duplications and deletions 〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,2002;43(6):1843-9.

9Ta CC,Gail S,Lisa AS,etal.Axenfeld-rieger syndrome:new perspectives〔J〕.Br J Ophthalmol,2012;96:318-22.

10Delahaye A,Khung SS,Aboura A,etal.Pre- and postnatal phenotype of 6p25 deletions involving the FOXC1 gene〔J〕.Am J Med Genet A,2012;158A(10):2430-8.

11Yu M,Bardia A,Wittner BS,etal.Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition〔J〕.Science,2013;339(6119):580-4.

12Xia L,Huang W,Tian D,etal.Overexpression of forkhead box C1 promotes tumor metastasis and indicates poor prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,2013;57(2):610-24.

13Xia L,Huang W,Tian D,etal.Overexpression of forkhead box C1 promotes tumor metastasis and indicates poor prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,2013;57(2):610-24.

14Zhang K,Zhang M,Zhao H,etal.S100A4 regulates motility and invasiveness of human esophageal squamous cell carcinoma through modulating the AKT/Slug signal pathway〔J〕.Dis Esophagus,2012;25(8):731-9.

15Sasaki K,Natsugoe S,Ishigami S,etal.Significance of Twist expression and its association with E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma 〔J〕.Exp Clin Cancer Res,2009;28:158.

16Groblewska M,Siewko M,Mroczko B,etal.The role of matrix metalloproteinases(MMPs)and their inhibitors(TIMPs)in the development of esophageal cancer〔J〕.Folia Histochem Cytobiol,2012;50(1):9-12.

〔2014-05-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：劉杰(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事腫瘤內科及腫瘤基礎研究。

基金項目：濟南市青年科技明星計劃資助課題(No.20110321)

〔中圖分類號〕R735.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0796-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.011