補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法對(duì)IgA腎病模型大鼠Th1/Th2的影響

張冬梅　王銀萍　王宏安　張洪寶　張守琳

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法對(duì)IgA腎病模型大鼠Th1/Th2的影響

張冬梅王銀萍王宏安張洪寶張守琳

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的探討補(bǔ)腎健脾，解毒利咽法對(duì)IgA腎病(IgAN)模型大鼠Th1/Th2的影響。方法選取體重(180±20)g的SD雄性大鼠72只，隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤多甙片組(對(duì)照組)、補(bǔ)腎健脾、解毒利咽中藥低、中、高劑量組，參照陸慧渝等報(bào)道的方法制備動(dòng)物模型，采用熒光半定量法檢測(cè)大鼠腎組織系膜區(qū)IgA沉積情況，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血清中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、干擾素(INF)-γ的表達(dá)水平。結(jié)果造模后大鼠出現(xiàn)不同程度食欲差、毛色雜亂，體重下降，腎組織系膜區(qū)出現(xiàn)IgA沉積；給藥后，各治療組大鼠IgA沉積有所減輕；與空白組比較，模型組大鼠血清IL-2、INF-γ的水平明顯下降(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平明顯升高(P<0.05)，Th1/Th2比值出現(xiàn)漂移；與模型組比較，各治療組血清IL-2、INF-γ的水平明顯上調(diào)(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平明顯下調(diào)(P<0.05)，Th1/Th2漂移改善，其中中藥組改善程度與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論IgAN模型大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表達(dá)紊亂，Th1/Th2出現(xiàn)漂移；補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法能夠調(diào)整細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表達(dá)水平，糾正Th1/Th2比值漂移。

〔關(guān)鍵詞〕補(bǔ)腎健脾；解毒利咽法；IgA腎病；細(xì)胞因子；Th1/Th2

第一作者：張冬梅(1985-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)的研究。

IgA腎病(IgAN)在中國(guó)發(fā)病率為45%~50%〔1〕，其中約15%~40%的IgAN患者在10年后將會(huì)進(jìn)展為終末期腎病(EsRD)〔2，3〕。任繼學(xué)教授認(rèn)為本病的病機(jī)核心為腎虛脾虧，而咽部感染是發(fā)病之源，提出以補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法治療本病，臨床應(yīng)用40年，療效顯著。本文旨在進(jìn)一步探討該療法的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取體重(180±20)g的SD雄性大鼠72只(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，全部大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及尿蛋白定性試驗(yàn)均為陰性。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品雷公藤多甙片：上海復(fù)旦復(fù)華有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020415；補(bǔ)腎健脾，解毒利咽方藥：生地黃20 g，生黃芪20 g，山萸肉20 g，山藥20 g，生茅根50 g，土茯苓30 g，生蒲黃15 g(包煎)，馬勃15 g，金蕎麥30 g，紫荊皮15 g，木蝴蝶15 g，甘草5 g。由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一煎制。

1.3試劑及儀器熒光顯微鏡TXM-500C，上海天省儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀318C，上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、γ-干擾素(INF-γ)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒，由上海信裕生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白由美國(guó)sigma公司提供；熒光素標(biāo)記兔抗大鼠IgA抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4動(dòng)物模型制備大鼠購(gòu)買后飼養(yǎng)1 w，以適應(yīng)環(huán)境。參照陸慧瑜等〔4〕報(bào)道的方法制備動(dòng)物模型，至第9周每組各選取2只取腎組織，利用熒光半定量(熒光半定量標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)內(nèi)外通用的五級(jí)法分級(jí)〔5〕)的方法判斷大鼠腎組織系膜區(qū)IgA的沉積強(qiáng)度，驗(yàn)證模型是否成功，整個(gè)過(guò)程密切觀察大鼠的一般活動(dòng)。

1.5動(dòng)物分組與給藥將選取的大鼠用隨機(jī)分組方式分為6組，每組12只，分別為模型組、空白組、雷公藤多甙片組(對(duì)照組)、補(bǔ)腎健脾、解毒利咽中藥低、高劑量組。

空白組：自造模成功起，給予4 ml·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)至12 w末；模型組：自第9周起，給予生理鹽水4 ml·kg-1·d-1灌胃，1次/d，至12 w末；對(duì)照組：自造模成功后起，給予雷公藤多甙片6 mg·kg-1·d-1，灌胃1次/d，持續(xù)至12 w末；中藥低劑量組：自造模成功后起，給予中藥湯劑4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生藥量8 g/kg，灌胃1次/d，持續(xù)至12 w末；中藥中劑量組：自造模成功后起，給予中藥湯劑4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生藥量16 g/kg，灌胃1次/d，持續(xù)至12 w末；中藥高劑量組：自造模成功后起，中藥湯劑4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生藥量32 g/kg，灌胃1次/d，持續(xù)至12 w末。

1.6觀察指標(biāo)觀察大鼠的一般狀態(tài)；造模后第9周每組取2只大鼠，采用熒光半定量檢測(cè)大鼠腎組織IgA沉積情況；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1一般狀況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠共死亡9只，造模后大鼠出現(xiàn)不同程度食欲差、毛色雜亂、腹瀉、體重下降，給予治療后各治療組大鼠食欲及毛色有所改善，體重增長(zhǎng)，其中以中藥組體重增長(zhǎng)較快。

2.2用藥后各組大鼠免疫熒光沉積情況空白組大鼠腎小球系膜區(qū)和毛細(xì)血管壁未見IgA沉積(-)，模型組大鼠有很強(qiáng)的彌漫性團(tuán)塊狀I(lǐng)gA沉積()，對(duì)照組及中藥低、中、高劑量組IgA沉積程度不同，但強(qiáng)度較模型組比較明顯減輕，見圖1。

2.3血清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表達(dá)情況模型組IL-2、INF-γ的水平較空白組下降(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平較空白組升高(P<0.05)。經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法中藥治療后，與模型組比較，各中藥組IL-2、INF-γ的水平上調(diào)，IL-4、IL-10的水平下調(diào)，糾正了Th1/Th2失衡狀態(tài)，其中中藥組改善程度與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表1。

圖1　各組大鼠免疫熒光沉積情況

組別IL-2(ng/ml)IL-4(pg/ml)IL-10(μg/L)INF-γ(pg/ml)INF-γ/IL-4空白組4.84±0.89105.11±10.9851.48±8.97789.51±20.947.12±0.54模型組2.45±1.412)159.23±11.142)81.64±9.152)453.36±13.612)4.08±0.21對(duì)照組3.49±0.671)106.32±10.321)53.16±8.311)731.67±19.361)7.12±0.54中藥低劑量組3.41±1.061)107.56±10.781)56.42±9.111)792.72±18.461)8.16±0.33中藥中劑量組4.46±3.271)106.37±9.681)54.72±9.631)823.41±15.751)8.14±0.24中藥高劑量組3.84±1.101)106.30±9.981)58.47±9.481)814.26±15.731)7.92±0.51

與模型組比較:1)P<0.05;與空白組比較:2)P<0.05

3討論

IgAN的重要發(fā)病機(jī)制是以IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積。目前已經(jīng)得到公認(rèn)，T輔助細(xì)胞分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群，其中Th1細(xì)胞主要分泌INF-γ及IL-2等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4及IL-10等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Th1和Th2細(xì)胞因子會(huì)分別誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向各自細(xì)胞亞群分化并促進(jìn)其細(xì)胞激活，而在正常情況下，Th細(xì)胞亞群之間是相互制約的，各類細(xì)胞因子對(duì)另一類細(xì)胞亞群的產(chǎn)生及活化都存在抑制作用，使Th1及Th2兩類細(xì)胞因子相互影響，相互制約，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔6,7〕。因此，Th1及Th2亞群應(yīng)保持平衡，其發(fā)生失衡與免疫性腎炎的發(fā)生密切相關(guān)。Nogaki等〔8,9〕在小鼠中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用IL-4和IL-5等Th2細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生異常糖基化的IgA。既往研究也表明，IgAN患者活動(dòng)期Th1/Th2失衡，即INF-γ下調(diào)、IL-4及IL-10上調(diào)，緩解后則Th1/Th2失衡糾正，即INF-γ上調(diào)、IL-4及IL-10下調(diào)，提示IgAN存在Th1/Th2失衡〔10〕。因此，能否運(yùn)用糾正Th1/Th2失衡的方法來(lái)治療IgAN是值得進(jìn)一步探索的，而直接采用輸注外源性Th1細(xì)胞因子及Th2細(xì)胞因子來(lái)糾正Th1/Th2失衡，目前還存在很大的困難，而中藥對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。

國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)教授認(rèn)為本病的病機(jī)核心為腎虛脾虧，而邪毒蘊(yùn)結(jié)咽喉是本病發(fā)病的使動(dòng)因素。正如《靈樞·經(jīng)脈篇》指出“腎足少陰之脈，……其直者從腎上貫肝膈，入肺中，循喉嚨，挾舌本”。可見咽喉屬腎絡(luò)肺，為外邪出入之門戶，邪毒從口鼻而入，盤踞于咽喉，形成乳蛾，從氣血之道侵犯于腎，形成伏邪，久而為毒，居于腎宮，形成咽喉→肺→腎的惡性循環(huán)。因此，腎炎的發(fā)生與復(fù)發(fā)以及病情的加重和咽喉密切相關(guān)。因此任老提出補(bǔ)腎健脾、解毒利咽之大法。綜上，補(bǔ)腎健脾、解毒利咽法治療IgAN具有較好的臨床療效，考慮與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表達(dá)水平、糾正Th1/Th2失衡的作用密切相關(guān)。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：張守琳(1969-)，女，博士，教授，主要從事中醫(yī)腎臟病的研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2015101214JC)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2014第65號(hào))；吉林省中醫(yī)藥管理局科技項(xiàng)目(No.2014-zd7)

〔中圖分類號(hào)〕R28

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)04-0798-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.012