翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及機制研究

宿世震　項東宇　孟繁偉　張欽德

264199　煙臺,山東中醫藥高等專科學校西醫教學部[宿世震(碩士研究生)、孟繁偉]，中藥系(項東宇、張欽德)

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·論著·

翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及機制研究

宿世震項東宇孟繁偉張欽德

264199煙臺,山東中醫藥高等專科學校西醫教學部[宿世震(碩士研究生)、孟繁偉]，中藥系(項東宇、張欽德)

【摘要】目的研究翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及機制。方法采用高脂高糖飼料喂養大鼠6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素復制2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠隨機分為模型組、陽性藥物對照組(羅格列酮，4 mg/kg)、翻白草黃酮低劑量組(3 g/kg)、翻白草黃酮高劑量組(6 g/kg)，同批次健康大鼠作為實驗的正常對照組，每組10只。藥物干預4周后，微量血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、放免法測定空腹胰島素(fasting insulin，FINS)并計算胰島素敏感性指數(insulin sensitivity index，ISI)、ELISA法測定腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平；部分胰腺組織勻漿后黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平、硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；取部分胰腺制作病理切片，光鏡下觀察胰腺組織形態變化。結果翻白草黃酮可降低大鼠的FBG、FINS、TNF-α、IL-6水平及改善胰島素抵抗，明顯提高大鼠胰腺組織中的SOD水平、降低MDA含量。病理切片顯示胰島細胞損傷明顯減輕，翻白草黃酮高劑量組(6.0 g/kg)作用明顯。結論翻白草黃酮對2型糖尿病大鼠胰島細胞具有保護作用，其保護作用可能是通過減輕胰腺組織內的氧化應激水平及降低全身炎癥反應而實現的。

【關鍵詞】翻白草；黃酮；2型糖尿病；大鼠；保護作用

糖尿病是以慢性血糖升高為特征的代謝紊亂性疾病，發病率逐年上升，目前認為，氧化應激、炎癥因子與糖尿病的關系密切，二者均可導致胰島β細胞損傷[1-2]。翻白草PotentilladiscolorBung.屬薔薇科委陵菜屬，又名雞腿根、天青地白等，其味甘、微苦，性平，無毒，全草及根入藥，主要含有萜類、黃酮類、多酚類等成分，具有抗菌、利尿、降糖、調脂等作用[3]。研究顯示，翻白草具有改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[4]，而黃酮類是翻白草的主要活性部位，故通過動物實驗的方法，探討翻白草黃酮對大鼠胰島細胞的保護作用及機制。

1材料和方法

1.1動物

健康Wister大鼠，SPF級，雄性，由山東大學實驗動物中心提供，醫學實驗動物合格證號：SCXK(魯)20090001，體質量195～206 g，飲水及攝食自由。

1.2實驗藥物

翻白草黃酮：翻白草，經山東中醫藥高等專科學校鑒定教研室張欽德教授鑒定為中藥翻白草PotentilladiscolorBung.的全草，烘干粉碎，90%乙醇，料液比1∶8，提取3次，合并提取液，減壓濃縮、萃取，減壓回收后真空干燥、粉碎過篩，冷藏備用。提取物中黃酮含量為70.5%，1 g提取物相當于生藥83 g，使用前，現配溶液濃度為72 mg/mL(相當于生藥6 g/mL)、復溫至25～30℃后進行灌胃治療。羅格列酮片(成都恒瑞制藥有限公司，批號:201400319)。

1.3試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美國Sigma公司，批號:S0130)。血清胰島素(fasting insulin，FINS)，批號:20140326；白細胞介素-6(interleukins，IL-6)，批號:20140314；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)，批號:20140306；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，批號20140319；考馬斯亮蘭蛋白，批號:20140318；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，批號:20140318；以上試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

微量血糖儀及配套試紙(德國羅氏診斷公司)；680酶標儀(美國Bio-rad公司)；SN-695 B型智能放免r測量儀(上海原子核研究所日環儀器一廠)；CX21BIM-SET6光學顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.4模型制備、分組及給藥

60只大鼠，適應性喂養1周后，按體質量分層隨機數字表法取10只作為正常對照組，普通飼料喂養；余50只高脂高糖飼料(飼料配方：豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎飼料59%)喂養，4周后，禁食12小時，1% STZ按40 mg/kg腹腔注射，1周后測糖負荷2小時血糖值，≥11.1 mmol/L為初選指標，穩定1周后分組[5]，最終成模42只。成模大鼠隨機數字表法分為四組，每組10只，即模型組、陽性藥物對照組(羅格列酮，4 mg/kg)、翻白草黃酮低、高劑量組(以生藥計，6 g/kg，12 g/kg)。正常對照組及模型組每次等體積的蒸餾水。灌胃給藥，每天1次，連續28天。

1.5指標檢測

實驗結束后(禁食8小時)，剪尾取血，微量血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。3%戊巴比妥麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，-20℃保存待測。放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin，FINS)，酶聯免疫法測定血清TNF-α、IL-6。計算胰島素敏感性指數(insulin sensitivity index，ISI)，ISI= 1/FBG×FINS。取血后立即取胰腺組織，部分用冷生理鹽水漂洗，拭干稱重、放入盛有預冷勻漿介質的燒杯中，剪碎組織，倒入勻漿器中研磨成組織勻漿，30000 rmp離心10分鐘，吸取上清液待測，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平、硫代巴比妥酸法測定MDA水平。部分胰腺組織常規固定、包埋制備石蠟切片后HE染色。

1.6統計學處理

表1　翻白草黃酮對糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI 的影響±s，n=10)

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與羅格列酮組比較，cP<0.01。

2結果

2.1翻白草黃酮對糖尿病大鼠一般狀態的影響

實驗過程中，正常對照組大鼠活潑、毛發整齊光滑、反應靈敏；造模大鼠在高脂高糖飼料喂養結束時形體肥胖、體質量增加明顯，注射STZ后逐漸呈現精神萎靡、懶動、多食、多尿，墊料潮濕臊臭，每日需更換墊料2次，同時模型大鼠體質量較造模前降低明顯。給予藥物干預4周后，與模型組比較，翻白草黃酮低、高劑量組大鼠的狀態明顯好轉，進食量、飲水量改善，體質量有所增加，毛發較整齊、光滑，且活動增加。

2.2翻白草黃酮對糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI的影響

模型組大鼠的FBG、FINS水平升高、ISI降低，與正常對照組比較差異顯著(P<0.01)，符合2型糖尿病的特點，提示模型復制成功。干預28天后，翻白草黃酮低、高劑量組的FBG、FINS水平下降，ISI升高，與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，呈劑量依懶性，但作用不及羅格列酮，見表1。

2.3翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺組織中SOD、MDA的影響

模型組大鼠胰腺組織中SOD水平下降、MDA含量升高，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。干預28天后，翻白草黃酮低、高劑量組胰腺組織中的SOD水平升高、MDA水平下降，與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，作用優于羅格列酮組(P<0.01)，翻白草黃酮高劑量組作用明顯，見表2。

2.4翻白草黃酮對糖尿病大鼠血清炎癥因子的影響

模型組大鼠TNF-α、IL-6水平呈現升高，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)；干預28天后，翻白草低、高劑量組大鼠的TNF-α、IL-6水平均不同程度降低，與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。高劑量組作用明顯，見表3。

表2　翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺組織中SOD、

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05；與羅格列酮組比較，dP<0.01。

表3　翻白草黃酮對糖尿病大鼠血清

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05；與羅格列酮組比較，dP<0.01。

2.5翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺形態的影響

每張切片觀察5個視野(×200)，計算細胞總數后取各張平均值進行比較。正常對照組大鼠胰島β細胞數較多，細胞核清楚，細胞界限清晰。模型組大鼠胰島體積縮小，β細胞數減少。與模型組比較，羅格列酮組及翻白草黃酮給藥組胰島體積增加，β細胞數增多。表明翻白草黃酮對糖尿病大鼠的胰島具有保護作用，見圖1。

圖1　翻白草黃酮對糖尿病大鼠胰腺形態的影響

3討論

高脂高糖飼料喂養聯合鏈脲佐菌素腹腔注射是近年來復制2型糖尿病大鼠模型較為常用的方法，本實驗中也采用了此方法，模型組大鼠出現了多尿、多飲、體重下降等表現，同時FBG、FINS升高及ISI下降，提示大鼠出現高糖、胰島素抵抗表現，符合2型糖尿病模型特征。翻白草黃酮治療后，FBG及FINS水平下降、ISI提高，與文獻報道一致[4]，翻白草具有改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂及胰島素抵抗的作用。同時在實驗中觀察到，翻白草黃酮可緩解糖尿病模型大鼠的“三多一少”癥狀及精神狀態。

“共同土壤”[6]學說的提出，讓人們注意到了氧化應激在糖尿病發生、發展中的作用。正常情況下，體內在代謝過程中生成的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)或活性氮簇，可被機體的抗氧化系統及時清除，若產生過多，超過機體清除能力，可導致組織、細胞的損傷，即為氧化應激。胰島β細胞內的抗氧化酶水平較低，對氧化應激敏感，所以更容易受到ROS的攻擊而受損[7]。目前認為，氧化應激可激活c-Jun氨基酸末端激酶，繼而激活蛋白轉錄因子的磷酸化，直接調控β細胞中凋亡相關基因的表達而促進β細胞凋亡；增多的活性氧還可促使生物膜脂質過氧化，致使細胞膜通透性增加，鈣內流增加，繼而激活磷脂酶，促進膜磷脂分解，導致β細胞損傷。而抗氧化劑可抑制β細胞凋亡[8]，進一步說明了氧化應激參與β細胞的損傷過程。在評價氧化應激時多采用SOD、MDA的含量測定，SOD是機體主要的抗氧化酶，可以清除自由基而減輕氧化應激損傷，其水平可以反映機體的抗氧化能力；MDA是生物膜脂質過氧化的產物，其水平可以反映體內的脂質過氧化程度。本研究結果顯示，模型組大鼠胰腺組織中的SOD水平降低、MDA水平升高，鏡下觀察胰島萎縮、體積縮小、β細胞減少，說明糖尿病大鼠胰腺組織中存在氧化應激狀態，其自由基清除能力降低，抗氧化能力降低，β細胞損傷。翻白草黃酮治療后，與模型組大鼠比較，胰腺組織中的SOD水平升高、MDA水平降低，鏡下觀察胰島體積增加、β細胞數增加，表明翻白草黃酮對胰島β細胞具有修復作用，其機制可能與降低糖尿病大鼠胰腺組織內的脂質過氧化、提高其抗氧化能力有關。

近年來提出，2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，炎癥因子與糖尿病及其并發癥的關系密切，體內的糖代謝紊亂可以刺激炎癥因子(如IL-6、TNF-α等)大量的生成，胰島β細胞同樣出現炎癥反應，繼而功能障礙和凋亡[2,9]。IL-6主要由白細胞合成分泌，可加速胰島素受體底物的降解，抑制酪氨酸自身磷酸化及磷脂酸肌醇-3-激酶活性，促進胰島β細胞的凋亡；高濃度的IL-6還可以誘導胰腺β細胞胞漿內不透明物質產生、自體吞噬的出現和線粒體的變形等細胞超微機構的變化，這些變化共同引起胰島β細胞死亡[10]。TNF-α主要由激活的巨噬細胞釋放，可以刺激β細胞內誘導型一氧化氮合酶在胰島細胞內的表達增加，促進NO的合成，從而影響β細胞的生長和增殖[11]，NO又能激活巨噬細胞釋放促炎癥因子，可激活核轉錄因子-кB，通過Fas途徑引起β細胞凋亡[12]。因此，炎癥狀態可導致胰島β細胞損傷，促進糖尿病的發生、發展。本實驗研究中，糖尿病模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著高于正常對照組，證實了2型糖尿病大鼠體內存在炎癥因子的過度表達。翻白草黃酮治療后，糖尿病大鼠的TNF-α、IL-6水平降低，表明翻白草黃酮可降低糖尿病大鼠體內的炎癥水平，從而保護胰島β細胞。

綜上所述，翻白草黃酮具有保護β細胞作用，促進β細胞修復，其保護作用可能是通過減輕胰腺組織內的氧化應激水平及降低全身炎癥反應而實現的。今后將繼續深入研究，明確翻白草黃酮促進β細胞修復的具體分子學機制。

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(本文編輯： 董歷華)

Flavonoids fromPotentilladiscolorBunge playing a protective and mechanical role for the type 2 diabetic rats islet cellXUShi-zhen，XIANGDong-yu，MENGFan-wei，etal.ShandongcollegeoftraditionalChinesemedicine，Yantai264199，China

【Abstract】ObjectiveThis article aims to study the protective mechanism of Flavonoids from Potentilla Discolor Bunge (PDB) to the type 2 Diabetic rats islet cell. MethodsUsing high fat-high sucrose diet to feed rats for 6 weeks, then the researchers copy the type 2 diabetic rats model with Streptozotocin(STZ). Model rats are randomly divided into the model group, the positive drug control group (rosiglitazone hydrochloride, 4 mg/kg), the low dose of flavone group (3 g/kg), and the high dose of flavone group (6 g/kg). At the same time, healthy rats are used as the experimental rats of normal group with 10 rats in each group. They are intervened by drug for 4 weeks. Then, trace blood sugar appearance tests fasting blood-glucose, radio immunity measures fasting insulin (FINS) and calculates insulin sensitivity index (ISI) and ELISA measures the level of tumor necrosis factor (TNF-α) and Interleukin-6(IL-6). Meanwhile, part of the pancreas tissue homogenate after xanthine oxidase method measures the level of SOD, and TBA measures the content of malondialdehyde (MDA). Take part of the pancreas pathological slices, and then observe the shape variation of the pancreas. ResultsFlavone from Potentilla Discolor Bunge(PDB) can reduce FBG, FINS, TNF alpha, and IL-6 levels and can improve insulin resistance. In addition, it is clear that it improves the level of SOD in the pancreatic tissue of rats and decreases MDA content. Pathological section shows an apparent reduction of the damage to islet cell, which is obvious in the high dose of flavonoids (6 g/kg). ConclusionFlavonoids from Potentilla Discolor Bunge (PDB) plays a protective role for type 2 Diabetic rats islet cell. In addition, the mechanism of its protective effect may through reducing the oxidative stress level in the pancreatic tissue and reducing the systemic inflammatory response.

【Key Words】Potentilla discolor；Flavonoids；Type 2 diabetes；Rat；Protective effect

(收稿日期：2015-08-12)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.02.005

作者簡介：宿世震(1979- )，2015級在讀碩士研究生，講師。研究方向：動物模型及解剖學研究。E-mail：ssz169@126.com