牙鲆dazl基因的克隆與表達分析

孫近近，張俊玲，孫文慧，施志儀

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

牙鲆dazl基因的克隆與表達分析

孫近近，張俊玲，孫文慧，施志儀

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

dazl（deleted in azoospermia-like）基因是多種物種精子發(fā)生的重要調(diào)控因子，為探討該基因在牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺發(fā)育分化中的作用，本研究采用同源克隆和RACE技術(shù)克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法分析了其序列結(jié)構(gòu)，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了該基因在牙鲆成體組織和早期發(fā)育階段的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牙鲆dazl cDNA序列全長2 031 bp，包括105 bp的5′端非翻譯區(qū)，1 275 bp的3′端非翻譯區(qū)和編碼217個氨基酸殘基的651 bp開放閱讀框；氨基酸同源序列比對顯示該序列存在一個高度保守的RRM（RNA recognition motif）結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域在魚類中具有100%的序列一致性；熒光定量PCR結(jié)果顯示dazl基因主要在牙鲆性腺中表達，且在精巢中的表達高于卵巢；在牙鲆早期發(fā)育階段，dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有較高的轉(zhuǎn)錄本，而在原腸胚期表達開始降低，至孵化后3 d一直保持較低的水平，這些豐富表達的母源性dazlmRNA可能參與了胚胎發(fā)育中原始生殖細胞的形成。本研究為進一步闡明dazl基因在牙鲆生殖發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)。

牙鲆；dazl；cDNA克隆；基因表達

DAZ基因家族包括daz、dazl（daz-like）和bolue基因，這3者的編碼蛋白均為RNA結(jié)合蛋白，在生殖細胞中特異表達，參與調(diào)節(jié)生殖細胞的發(fā)育和分化［1－2］，是精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的主要調(diào)控因子［3］。bolue和dazl是常染色體基因，一般認為bolue是DAZ基因家族的祖先基因（ancestral gene），在無脊椎動物和脊椎動物中都存在，其在睪丸中表達（蠕蟲除外），調(diào)控精子的正常發(fā)生；dazl起源于bolue基因，僅在脊椎動物中存在，它在生殖細胞和胚胎干細胞中表達，迄今研究表明其功能至少是精子生成的重要調(diào)控因子；daz基因是dazl的多拷貝基因，定位于Y染色體上，在人類和舊世界猴中的睪丸中表達，其缺失將導(dǎo)致精子生成停滯。

目前，dazl在人類（Homo sapiens）［4］、鼠（Mus musculus）［5］、爪蟾（Xenopus laevis）［6］、蠑螈（Cynops orientalis）［7］、斑馬魚（Danio rerio）［8］、青鳉（Oryzias latipes）［9］等物種中均有發(fā)現(xiàn)。功能缺失實驗表明dazl基因在減數(shù)分裂和生殖細胞發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用［1］。在非洲爪蟾和斑馬魚中，dazlmRNA是卵子發(fā)生和胚胎形成中生殖質(zhì)的重要成分［10］，因此它也成為追蹤生殖細胞發(fā)育和生殖質(zhì)特化的分子標(biāo)記。在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［11］和中華鱘（Chinese sturgeon）［12］中，dazl只存在于精巢和卵巢中，且在卵母細胞的早期發(fā)育中即能檢測到，研究發(fā)現(xiàn)dazl蛋白參與中華鱘雌雄的有絲分裂和減數(shù)分裂過程；同樣，在異育銀鯽（Garassiusauratusgibelio）中，dazl僅在卵巢中表達（精巢未檢測），且在原始生殖細胞形成中起重要作用［13］。在青鳉中，dazl是雌雄胚胎發(fā)育和配子發(fā)生的關(guān)鍵［9］；研究也表明dazl基因參與了半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）的雌雄性腺分化［14］。

牙鲆隸屬鰈形目（Pleuronectiforms），是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類［15］，雌性個體明顯大于雄性個體，有關(guān)牙鲆性別決定和生殖調(diào)控的分子調(diào)控機制研究備受重視。鑒于dazl基因在脊椎動物生殖中的重要作用，本研究采用RT-PCR及RACE法分離與克隆了牙鲆dazl基因，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了該基因在牙鲆各組織及胚胎發(fā)育各時期的表達情況，為進一步研究DAZ基因家族在牙鲆生殖發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

牙鲆胚胎和仔魚來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站，分別采集未受精卵、受精卵、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、胚孔封閉期、心跳期、孵化前期、孵化期胚胎和3 d仔魚。成魚購自上海市銅川路水產(chǎn)品市場，解剖取腦、鰓、肝、腎、卵巢、精巢、心臟、肌肉、胃和腸組織。各樣品經(jīng)DEPC水沖洗干凈后在液氮中速凍，然后置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

上述各牙鲆樣品依照Trizol試劑盒（Invitrogen）方法提取總RNA。總RNA用Agilent 2100 Bioanalyzer測定OD260/OD280值及濃度，P值均在1.8～2.0之間。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，確認RNA質(zhì)量能夠滿足后續(xù)實驗要求，置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所得總RNA用DNase I（Promega）處理后作為模板，按以下體系進行反轉(zhuǎn)錄：在無RNase的離心管中加入2μg總RNA，1μL OligodT Primer（50μmol·L－1），1μL dNTPMixture（10 mmol· L－1each），補充RNase freedd H2O至10μL；然后在PCR儀上進行變性、退火反應(yīng)，條件為65℃5 min，冰上急冷；加入以下試劑：5 x PrimeScript Buffer 4μL，RNase Inhibitor（40 U·μL－1）0.5 μL，PrimeScript RTase（200 U·μL－1）1μL，補充RNase free ddH2O至20μL；然后在PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42℃60 min，72℃15 min，然后冰上放置2 min，－20℃保存。

1.3 牙鲆dazl基因的克隆

根據(jù)己知物種同源基因，設(shè)計dazl基因的簡并引物（表1，dazl-f和dazl-r），取牙鲆性腺組織cDNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸12 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑盒純化回收，并將其連接到pMD19-T載體上，16℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，經(jīng)藍白斑篩選，挑選白色單菌落，培養(yǎng)后做菌落PCR鑒定，挑選正確的陽性克隆抽提質(zhì)粒后送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 用于PCR擴增的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amp lification

根據(jù)所得dazl基因片段，設(shè)計3′-RACE outer primer和3′-RACE inner primer引物（表1）進行巢式PCR，PCR反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。同樣根據(jù)所得牙鲆dazl序列設(shè)計5′-RACE outer primer和5′-RACE inner primer（表1），首先依照5′-Full RACE Kit（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄合成5′-RACE cDNA鏈，然后進行5′-RACE PCR擴增，PCR反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸65 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。3′-RACE和5′-RACE PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收純化目的片段，進行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。

1.4 序列及系統(tǒng)進化分析

首先用BioEdit軟件［16］將測序所得的序列拼接得到全長cDNA，然后利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html/）軟件分析序列開放閱讀框（open reading frame，ORF）；利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set＿mode.cgi？NORMAL＝1）和swissmodel（http：//www.swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測其二級和三級結(jié)構(gòu)。利用NCBI website（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）中的BLAST程序?qū)λ胏DNA序列和氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行對比；用BioEdit軟件進行不同物種該基因的核苷酸序列和氨基酸序列的比對；利用MEGA 5.1［17］構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹，其他脊椎動物的dazl氨基酸序列均從NCBI中GenBank下載，登錄號如下：羅非魚（Oreochromis niloticus），XP＿005453868.1；斑馬魚，AAH76423.1；虹鱒，ADW41782.1；青鳉，NP＿001098269.1；網(wǎng)紋鳉（Poecilia reticulate），XP＿007562718.1；半滑舌鰨，NP＿001281163.1；非洲爪蟾，NP＿001081772.1；紅腹蠑螈（Cynops pyrrhogaster），BAD38676.1；西部錦龜（Chrysemys picta bellii），XP＿005297093.1；小鼠，NP＿001264792.1；山羊（Capra hircus），AFR36910.1；白頰長臂猿（Nomascus leucogenys），XP＿003265409.1；人，NP＿001342.2。

1.5 dazl基因的實時熒光定量PCR

設(shè)計高效特異的引物（表1，qdazl-f和qdazlr），在CFX96TouchTMReal Time PCR Detection System（Bio-Rad）上進行定量檢測。首先制備目的基因和內(nèi)參基因（β-actin）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。20μL反應(yīng)體系包括了1μL cDNA（從100 ng～0.1 ng，10倍梯度稀釋），0.2μL特異性引物，10μL 2× iQTMSYBR Green Supermix（Bio-rad）和8.6μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃1 min；95℃10 s和63℃15 s，采集熒光40次，然后進行融解曲線的擴增。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示目的基因和內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，相應(yīng)的擴增效率均介于95%～100%之間。隨后對所有樣品進行定量檢測，PCR反應(yīng)體系和條件同上，實驗重復(fù)3次。

牙鲆dazlmRNA的相對表達量采用2－△△CT法計算，其數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，生物學(xué)重復(fù)（n）＝3。牙鲆各發(fā)育時期以孵化期中的相對mRNA量為對照，牙鲆不同組織以腸中的相對mRNA量為對照。統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA），使用Dunnett’s T3 test進行比較，當(dāng)P＜0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆dazl cDNA克隆和結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)普通PCR擴增得到616 bp的cDNA片段，在此基礎(chǔ)上進行5′-RACE和3′-RACE擴增，分別得到180 bp和1 388 bp的cDNA片段（圖1），經(jīng)軟件拼接得到牙鲆dazl基因的全長cDNA序列。

圖1 RACE法克隆牙鲆dazl基因全長cDNAFig.1 Full-length cDNA cloning of P.olivaceus dazl gene by RACE technology

牙鲆dazlcDNA全長2 031 bp，其中包含105 bp的5′端非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR），1 275 bp的3′-UTR和編碼217個氨基酸殘基的651 bp開放閱讀框。在其3′-UTR區(qū)域包含6個與mRNA瞬時表達有關(guān)的快速降解信號（圖2-a）。通過SMART預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白在34～103氨基酸處有一個典型的RNA識別基序（RNA recognitionmotif，RRM），其中含有分別具8個和6個保守氨基酸的核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）1和2基序，在RNP1和RNP2的兩側(cè)是一些散布的疏水性氨基酸；在154～163處有一個低復(fù)雜區(qū)域（low complexity）；在164～188處有一個DAZ repeat基序（圖2-a、b）。通過swissmodel預(yù)測牙鲆dazl蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示RRM的βαββαβ的二級結(jié)構(gòu)形成4條反向平行β片層結(jié)構(gòu)，2個α螺旋與β片層結(jié)構(gòu)的方向相垂直。dazl蛋白的N-端開始為一段無規(guī)則卷曲，之后形成一段α螺旋，在一段連接肽之后，序列回折形成β-折疊，殘基構(gòu)成了一個典型RRM。DAZ repeat基序在結(jié)構(gòu)中的二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為無規(guī)卷曲并帶著少量的α螺旋（圖2-c）。

2.3 牙鲆dazl基因的同源性和系統(tǒng)進化分析

BLAST搜索和BioEdit軟件序列比對分析（圖3）顯示，牙鲆dazlcDNA推導(dǎo)出的全部氨基酸序列與尖吻鱸（Lates calcarifer）、羅非魚、紅麗魚（Pundamilia nyererei）、網(wǎng)紋鳉、虹鱒、青鳉、半滑舌鰨和斑馬魚的同源性分別為80%、78%、78 %、78%、70%、68%、65%和64%，與兩棲動物爪蟾和哺乳動物小鼠、山羊和人類的同源性只有25%、26%、28%和28%。而對其RRM區(qū)氨基酸比對分析則發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在脊椎動物中是高度保守的，且與魚類的一致性可達到100%。

圖2 牙鲆dazl基因的cDNA、氨基酸序列及其蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)Fig.2 cDNA sequence，am ino acid and protein of the secondary and tertiary structure of P.olivaceus dazl gene

圖3 牙鲆dazl和其它物種的氨基酸序列對比Fig.3 Com parison of am ino acid sequence alignment of P.olivaceus dazl w ith that of other species

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），發(fā)現(xiàn)牙鲆dazl與所有魚類dazl聚為一支，而兩棲類、爬行類與哺乳動物等聚為另一支。

圖4 基于dazl蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的NJ樹Fig.4 NJ tree based on am ino acid sequences of dazl protein

2.4 牙鲆dazl基因的組織分布及在早期發(fā)育中的表達

熒光定量PCR結(jié)果（圖5-a）顯示，dazl基因主要在牙鲆性腺中表達，且在精巢中比在卵巢中有更為豐富的表達（P＜0.05）。而在其它各組織中僅有微弱的表達。

在牙鲆早期發(fā)育階段，dazl基因在未受精卵、受精卵以及受精后囊胚期均有較高的表達；而在受精后原腸胚期的表達開始降低，至神經(jīng)胚期已降至很低的水平，且直到孵化后的3 d都保持很低的表達水平。

3 討論

圖5 dazl基因在牙鲆各組織及早期發(fā)育中的表達Fig.5 Relative expression levels of dazl in different tissues and at early developmental stages of P.olivaceus

本研究采用RACE法克隆得到牙鲆dazl基因的全長cDNA。序列分析表明牙鲆dazl蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，和其它物種一樣，其存在一個高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有兩個核蛋白信號基團RNP1和RNP2［18－20］，能特異地結(jié)合各種不同的RNA分子［21］，與其蛋白功能有著密切關(guān)系［22－23］。系統(tǒng)進化樹表明，dazl基因在不同物種間有較高的同源性，并且在物種的系統(tǒng)進化中是比較保守的。

本研究發(fā)現(xiàn)，dazl基因主要在牙鲆性腺中表達，且在精巢中的表達高于卵巢，這和在青鳉［9］、虹鱒［11］、半滑舌鰨［14］等魚的表達是一致的，表明dazl基因在魚類的兩性性腺中特異表達，可能參與魚類生殖細胞的發(fā)育和雌雄配子的發(fā)生。在爪蟾中，卵dazlmRNA的缺失可導(dǎo)致原始生殖細胞的缺失［1］。小鼠dazl同源基因的無義突變可引起雌、雄兩性不育，在發(fā)生無義突變的9日齡小鼠睪丸組織中幾乎沒有生殖細胞，而在同日齡對照組的野鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)大量的A型精母細胞，而不是前細線期精原細胞［24］。并且dazl基因發(fā)生無義突變的小鼠精子發(fā)生障礙主要表現(xiàn)在從A型精母細胞到A1型細胞的分化失敗，表明dazl基因是A型精母細胞分化所必需的。以上研究結(jié)果表明，dazl基因參與了調(diào)節(jié)生殖細胞的發(fā)育和分化［18－25］，是精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的主要調(diào)控因子［19］。

在牙鲆早期發(fā)育階段，dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有較高的轉(zhuǎn)錄本，而在原腸胚期表達開始降低，至孵化后3 d一直保持較低的水平。與此類似，斑馬魚dazlmRNA在原腸胚期之前表達量也很高，隨后迅速降低［25］；同樣，dazlmRNA在異育銀鯽卵子、受精后1細胞期至囊胚期均有豐富的表達，而在之后逐步消失［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽成熟卵子中，dazl蛋白集中于植物極皮質(zhì)層，受精后dazl蛋白逐步遷移到卵裂球，隨著胚胎發(fā)育過程中原始生殖細胞的形成和遷移，dazl蛋白被限制在原生殖細胞中［1］。這些結(jié)果表明dazl基因是母源性基因，貯存在卵子中的mRNA在受精后翻譯成蛋白，用于原生殖細胞的形成。因此，dazl基因是魚類生殖調(diào)控的重要因子，本研究關(guān)于dazlcDNA序列的克隆與表達分析對于進一步研究其在牙鲆性腺分化過程中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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M olecular cloning and expression analysis of dazl gene in Paralichthys olivaceus

SUN Jin-jin，ZHANG Jun-ling，SUNWen-hui，SHIZhi-yi
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，ShanghaiOcen University，Shanghai201306）

dazl（deleted in azoospermia-like）gene is an important regulator of a variety of species of spermatogenesis.To explore the role ofdazlgene in gonad differentiation and development ofParalichthys olivaceus，the full-length cDNA ofdazlgene was cloned using homology cloning and RACE technology，its sequence structure was analyzed by bioinformaticsmethod，and its gene expression in different adult tissues and during early development ofP.olivaceuswas studied using real-time PCR technology.The results showed that the full-length cDNA sequence ofP.olivaceus dazlwas 2 031 bp，including 105 bp of 5′untranslated region，1 275 bp of 3′untranslated region and 651 bp of open reading frame encoding 217 amino acid residues.Thedazlhad a highly conserved RNA recognition motif，which shared 100%sequence similarities among fish species by amino acid sequence homology comparison.RT-qPCR results showed that thedazlgene wasmainly expressed in gonad，and it had a higher expression level in testis than in ovary.During the early development，thedazlgene had higher transcriptions in the unfertilized egg，fertilized egg and blastocysts，and its expression began to reduce at gastrula stage，and remained at a low level until3 days after hatching.These results suggest that the abundantmaternaldazlmRNA may be involved in the formation of primitive germ cells in the embryonic development.This study provides a basis to further clarify the role ofdazlgene inP.olivaceusreproductive development.

Paralichthys olivaceus；dazl；cDNA cloning；gene expression

Q 782

A

1004－2490（2016）04－0391－09

2016－01－17

國家自然科學(xué)基金青年項目（41306128），國家自然科學(xué)基金面上項目（30271017）

孫近近（1989－），女，安徽人，在讀理學(xué)碩士，生物學(xué)方向。Tel：021－61900437，E-mail：jjsun1110＠163.com

施志儀，教授。Tel：021－61900437，E-mail：zyshi＠shou.edu.cn