盤狀紅斑狼瘡患者T淋巴細胞CD70基因啟動子區域甲基化水平的研究

葉筱燕，丁艷，蒙秉新，張燕，蘇建英，王玉文，王遠志

（1.海南省人民醫院皮膚科，海南海口570102；2.海南省婦女兒童醫院皮膚科，海南海口570206）

盤狀紅斑狼瘡患者T淋巴細胞CD70基因啟動子區域甲基化水平的研究

葉筱燕1，丁艷2，蒙秉新1，張燕1，蘇建英1，王玉文1，王遠志1

（1.海南省人民醫院皮膚科，海南海口570102；2.海南省婦女兒童醫院皮膚科，海南海口570206）

目的研究盤狀紅斑狼瘡(DLE)患者T淋巴細胞CD70 mRNA的表達及CD70基因啟動子DNA甲基化的狀態，探討CD70在DLE發病機制中作用。方法將2014年1月至2015年6月的15例活動期、15例非活動期DLE患者和15例正常人對照組外周血中T淋巴細胞的分離以及DNA、RNA提取，然后以定量RT-PCR測定CD4+細胞和CD8+細胞中CD70 mRNA轉錄水平，亞硫酸氫鈉基因測序法檢測CD4+細胞和CD8+細胞CD70基因啟動子區域甲基化水平。結果活動期、非活動期和健康對照組DLE患者CD4+T淋巴細胞中的CD70 mRNA轉錄水平分別為(0.82±0.21)、(0.61±0.15)和(0.43±0.11)，呈逐步遞減趨勢，且兩兩比較差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，活動期、非活動期DLE患者和健康對照CD4+T淋巴細胞CD70基因啟動子序列-600～-300 bp區域平均甲基化水平分別為(0.29±0.05)、(0.41±0.03)和(0.59±0.02)，呈逐步遞增趨勢，且兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.01).結論DLE患者T淋巴細胞中CD4+細胞CD70基因啟動子區域的低甲基化狀態可能引起CD70過度表達，這為DLE疾病患者的檢測提供又一指標。

盤狀紅斑狼瘡；T淋巴細胞；CD70基因；甲基化

盤狀紅斑狼瘡(DLE)是紅斑狼瘡(LE)的一個亞型。DLE是一種累及皮膚與黏膜的慢性結締組織疾病，其臨床特征是界限清楚的紅色斑塊、毛囊栓塞、鱗屑、毛細血管擴張以及皮膚萎縮等，常見于女性[1-2]。目前對盤狀紅斑狼瘡的病因和發病機制尚不清楚，故臨床上至今仍缺乏有效的療法。

研究表明，T細胞DNA低甲基化調控相關基因的表達在免疫性疾病中扮演著重要的角色[3]。CD70全稱為腫瘤壞死因子配體超家族7因子，是CD27的配體，主要于活化的CD4+和CD8+T細胞以及B細胞上表達[4]，目前普遍認為CD70基因亦是狼瘡相關甲基化敏感基因之一[5-6]，CD27-CD70系統紊亂可導致一系列免疫異常且CD27抗原是DLE疾病活動的一個標志，故CD70基因的表達與免疫性疾病進展活動密切相關[7]。但T細胞CD70基因的甲基化是否在DLE的發病中也起到一定的作用，目前國內外相關的研究尚少，本研究通過研究DLE患者T淋巴細胞CD70 mRNA的表達及CD70基因啟動子DNA甲基化的狀態，探討CD70的甲基化在DLE中的作用，以期為進一步明確DLE在基因及分子水平的發病機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料30例DLE患者，均符合美國風濕病協會(ARA)1997年修訂的DLE診斷標準的四項指標。其中活動期DLE 15例，皆為本科室2014年1月至2015年6月住院及門診患者，女性13例，男性2例，平均年齡(26.8±5.7)歲；非活動期DLE 15例，男性1例，女性14例，平均年齡(25.5±6.2)歲，皆為本科門診隨訪患者。健康對照組15例，皆為本院體檢中心健康體檢者，家族中無自身免疫性疾病史，女性14例，男性1例，平均年齡(26.5±5.3)歲。各組樣本來源的患者在性別和年齡構成上差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 試劑及其儀器CD70：5'-TGCTTTGGTCCCATTGGTCG-3'，5'-TCCTGCTGAGGTCCTGTGTGATTC-3'(上海博亞生物技術有限公司)。QPCR反應儀為ABΙ 7500(ABΙ公司)；Real Time反應試劑盒(OMEGA公司)；逆轉錄試劑盒(Sigma公司)；免疫磁珠(德國MiltenyiBiotec公司)；TRΙZOL試劑(美國Ιnvitrogen公司)；NaHSO3(美國Sigma公司)；Wizard@DNA純化樹脂(美國Promega公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 T淋巴細胞分離及其DNA、RNA抽提各組樣本中取靜脈血30 mL(肝素抗凝)。采用淋巴細胞分離液常規分離方法分離外周血單核細胞。按說明書操作用免疫磁珠分離T淋巴細胞CD4+和CD8+細胞。用TRΙZOL試劑按操作說明操作提取總RNA以及基因組DNA，檢測濃度及純度后，-20℃保存備用。

1.3.2 實時定量PCR檢測CD70 mRNA轉錄水平任取樣本中所提取的RNA逆轉錄成cDNA為模板。對倍稀釋成l/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×五個梯度，以此為模板分別以CD70基因與β-肌動蛋白基因(內參照基因)的特異引物進行實時PCR，2個復孔。反應條件如下：50℃15 min，1個循環；95℃15 min，1個循環;94℃15 s，55℃30 s，40個循環；72℃30 s；內參基因為β-肌動蛋白：5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，5'-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3'。

1.3.3 亞硫酸氫鈉基因測序法檢測CD4+細胞和CD8+細胞CD70基因啟動子區域甲基化水平NaHSO3處理基因組DNA后，按Wizard@DNA純化樹脂說明書操作回收純化DNA。以特定引物序列PCR擴增CD70基因調控序列片段后進行連接、轉化并測序：擴增產物與T載體進行連接，由CaCl2將其轉化至感受態菌后培養，挑克隆、搖菌，再將經鑒定為陽性的克隆后送測序。每個目的片段各送6個克隆測序，取平均值。測序由華大基因完成。計算患者的每個CpG位點的平均甲基化水平。

1.4 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T淋巴細胞中CD70基因mRNA轉錄水平情況活動期、非活動期DLE患者T淋巴細胞中CD70 mRNA轉錄水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，且活動期DLE患者的轉錄水平顯著高于非活動期患者，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖1。活動期、非活動期DLE患者T淋巴細胞中CD4+CD70 mRNA轉錄水平明顯高于健康對照組(P＜0.01)。活動期DLE患者T淋巴細胞CD4+的CD70 mRNA轉錄水平高于非活動期DLE患者中的轉錄水平(P＜0.05)；活動期、非活動期DLE患者T淋巴細胞CD8+的CD70 mRNA轉錄水平與健康對照組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

圖1 DLE患者與正常對照組T淋巴細胞中CD70 mRNA的水平比較

圖2 CD4+細胞和CD8+細胞中CD70 mRNA的水平比較

2.2 PCR擴增CD70基因調控區域片段以基因組DNA為模板擴增CD70基因調控區域片段，條帶大小約1.3 kb，經限制性內切酶酶切后可以獲得大小一致的片段(圖3)。說明擴增片段成功連入到T載體上。

圖3 PCR擴增CD70基因

2.3 CD4+細胞和CD8+細胞的CD70基因啟動子區域甲基化狀態活動期、非活動期DLE患者組的CD4+細胞的基因啟動子序列-1 000～-600 bp，～300 bp至轉錄起始位點之間CG對的平均甲基化水平與健康對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。而在-600～-300 bp，包含有增強子3'端周邊區域，活動期、非活動期DLE患者組CG對的平均甲基化水平均明顯低于健康對照組(P均＜0.01)，且活動期平均甲基化水平明顯低于非活動期DLE患者組(P＜0.01)。活動期、非活動期DLE患者組中CD8+細胞CD70基因啟動子序列-1 000～-600 bp，-600～-300 bp，-300 bp至轉錄起始位點CG對的平均甲基化水平與健康人比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 三組受檢后T淋巴細胞中CD70 mRNA的水平比較(±s)

表1 三組受檢后T淋巴細胞中CD70 mRNA的水平比較(±s)

注，與健康對照組比較，aP＜0.01；與非活動組比較，bP＜0.01。

組別例數CD4+CD8+健康對照組非活動組活動組F值P值15 15 15 -1 000～-600 bp 0.80±0.02 0.83±0.07 0.81±0.04 5.8＞0.05 -600～-300 bp 0.59±0.02 0.41±0.03a0.29±0.05ab0.55＜0.01 -300～0 bp 0.23±0.01 0.19±0.06 0.20±0.04 0.75＞0.05 -1 000～-600 bp 0.91±0.04 0.89±0.03 0.92±0.02 0.40＞0.05 -600～-300 bp 0.82±0.06 0.84±0.03 0.85±0.04 0.94＞0.05 -300～0 bp 0.17±0.07 0.19±0.05 0.16±0.04 0.64＞0.05

3 討論

在機體處于變態反應或者在自身免疫反應等條件下，T淋巴細胞經活化刺激后，可大量表達CD70[8-9]，T淋巴細胞與其配體CD27的結合，可以作為T淋巴細胞的輔助/共刺激信號進而調控B細胞的激活[10]；而CD27-CD70的系統紊亂可導致一系列機體的免疫異常，CD27可以促進人B細胞產生免疫球蛋白，與漿細胞的分化增強有關[11]；CD70與CD27的結合為B細胞分泌ΙgG抗體提供了協同刺激信號[12]，使得狼瘡患者外周血中B淋巴細胞的異常表達以及依賴T細胞分泌ΙgG[13-14]。因此CD70可能與疾病活動密切相關，如在B細胞異常活躍中的作用。

本研究發現活動期、非活動期DLE患者較健康對照組CD4+細胞CD70基因調控區域處于相對低的甲基化狀態，且活動期較非活動期DLE患者甲基化狀態更低。實驗結果顯示：活動期、非活動期DLE患者組CD4+細胞CD70基因調控區域中-600～-300 bp CG對的平均甲基化水平明顯低于健康對照組；活動期、非活動期DLE患者中CD4+細胞的CD70 mRNA轉錄水平明顯高于健康對照組。CD70基因中的部分啟動子活躍性片段處于低甲基化狀態可能是CD70基因的被活化進而引起其過度表達的原因，CD70基因的過度表達可能在DLE的發生和發展過程中起著重要作用。另外活動期DLE患者較非活動期患者的CD4+細胞CD70基因片段甲基化狀態更為低下且活動期DLE患者CD4+細胞的顯著高于非活動期DLE患者，提示CD70基因啟動子甲基化水平可能通過影響其轉錄水平進而與DLE的活動性相關。而CD8+細胞的CD70基因啟動子甲基化狀態在DLE患者各組中以及與健康對照組之間的比較中差異均無統計學意義。因此，DLE患者T淋巴細胞中CD4+細胞CD70基因啟動子區域的低甲基化狀態可能引起CD70過度表達，這為DLE疾病患者新的檢測指標上提供一定的實驗依據。

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Study on methylation status of CD70 gene promoter in T cells from patients with discoid lupus erythematosus.

YE Xiao-yan1,DING Yan2,MENG Bing-xin1,ZHANG Yan1,SU Jian-ying1,WANG Yu-wen1,WANG Yuan-zhi1. 1.Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,CHINA;2.Department of Dermatology, Maternal&Child Health Hospital of Hainan Province,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo detect the expressions of CD70 mRNA,determine the methylation status of CD70 gene promoter in T cells from patients with discoid lupus erythematosus(DLE),and explore the role of CD70 in mechanism of DLE.MethodsBlood samples were obtained from 15 patients with active DLE,15 patients with unreactive DLE and 15 normal human controls from January 2014 to June 2015.Quantitative RT-PCR was carried out to quantify the mRNA expression of CD70,and bisulfite sequencing was used to evaluate the methylation status of CD70 gene promoter in CD4+and CD8+T cells.ResultsThe transcriptional level of CD70 mRNA in CD4+T lymphocytes in active DLE patients,inactive patients and healthy controls were respectively(0.82±0.21),(0.61±0.15)and(0.43±0.11),with a decreasing trend.There are significant differences in each paired comparison(P＜0.01).The average methylation index of the region between-600 bp and-300 bp of CD70 gene promoter in CD4+T cells of the patients with active DLE(0.29±0.05)and inactive DLE (0.41±0.03),which was significantly lower than that in the healthy controls(0.59±0.02)(P＜0.01).ConclusionThe CD70 gene promoter in CD4+T cells is significantly hypomethylated in patients with DLE,which may directly lead to the overexpression of CD70,and could be used as an important index of disease detection in patients with DLE．

Discoid lupus erythematosus(DLE);T lymphocytes;CD70 gene;Methylation

R758.62

A

1003—6350（2016）13—2070—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.002

2016-01-14)

海南省衛生廳衛生計生行業科研項目（編號：瓊衛2013自籌-33）

王遠志。E-mail：wangyuanzhi407@163.com