液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍

符策奕，梁穎，許文佳，陳朝曼

(海南省藥品檢驗所化妝品室，海南海口570216)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍

符策奕，梁穎，許文佳，陳朝曼

(海南省藥品檢驗所化妝品室，海南海口570216)

目的建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍的定性、定量方法。方法樣品經(jīng)甲醇超聲提取，HLB固相萃取柱分離，再通過C18色譜柱(Kinetex C18 2.6 μm 100A100×2.10 mm)分離，采用電噴霧離子源及多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對目標(biāo)化合物進行測定。結(jié)果溴甲酚綠與溴百里酚藍的方法檢出限分別是0.82 mg/kg、0.84 mg/kg。溴甲酚綠與溴百里酚藍的線性范圍均為0.02～4 μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5(rBG= 1.000 0，rBB=0.999 9)，在不同劑型的化妝品中平均回收率在98.0%～109%范圍內(nèi)。結(jié)論該方法具有前處理簡單，結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適用于化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍的測定。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；化妝品；溴甲酚綠；溴百里酚藍

隨著近年來人民生活水平的不斷提高，化妝品也逐步走進千家萬戶，但化妝品帶來的過敏性疾病數(shù)量也在不斷增加，這已成為過敏性皮炎的主要來源之一[1-3]。為了帶給消費者更好的感官效果，化妝品中往往添加各種著色劑，而禁限著色劑濫用的情況同樣存在[4-5]。溴甲酚綠與溴百里酚藍屬于具有刺激性的著色劑，溴甲酚綠(Xi)屬于R36類化學(xué)品，即具有刺激眼睛系統(tǒng)功能；溴百里酚藍屬于S24/25類化學(xué)品，應(yīng)避免眼睛和皮膚接觸。在我國衛(wèi)生部頒發(fā)的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007年版與歐盟化妝品檢測指導(dǎo)書(No：1223/ 2009)中規(guī)定溴甲酚綠與溴百里酚藍專用于僅和皮膚暫時接觸的化妝品(Rinse-off product)[6-7]。目前我國尚未建立化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍的檢測方法，因此市面上的產(chǎn)品是否添加了上述限用的著色劑無法獲得準(zhǔn)確的評價[8-11]。

本文擬建立一種適用于化妝品的溴甲酚綠與溴百里酚藍檢測方法以監(jiān)測上述著色劑在化妝品中的使用情況，為上述限用物質(zhì)的監(jiān)督檢查提供必要依據(jù)。為了保證新建方法不受到各種原輔料的干擾，提高方法的專屬性，本文采用固相萃取柱與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀相結(jié)合的方式對多種不同類型的基質(zhì)樣品進行分析。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備Thermo U3000液相色譜串聯(lián)AB APΙ4000+質(zhì)譜儀；色譜柱:Phenomenex Kinetex C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；Mili-Q超純水器(Millipore)；電子分析天平(Mettler Toledo AL204)；超聲波提取儀(KUDOS SK8210LHC)。

1.1.2 試劑與耗材乙腈(LC-MS級，Merk)、甲醇(LC-MS級，Merk)、甲酸(色譜級，TEDΙA)、水(超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm)、HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，Oasis)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溴甲酚綠(Bromocresol green，sigma，以干品計含量為95.4%)、溴百里酚藍(Bromothymol Blue，sigma，以干品計含量為95%)。取溴甲酚綠與溴百里酚藍標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解稀釋成含量約2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)儲備液。再用甲醇配制成溴甲酚綠與溴百里酚藍濃度分別為202.1 μg/mL、207.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于-20℃保存。

1.2 前處理方法精密稱取樣品約0.5 g，置25 mL比色管中加甲醇20 mL，振蕩渦旋1 min，使樣品與溶劑充分混勻，超聲提取20 min后放冷至室溫再用甲醇定容至刻度，混勻后精密量取上述樣品液1 mL置活化好的HLB固相萃取柱中，以1滴/2s的速度過柱，再用甲醇3 mL分3次洗滌固相萃取柱，抽干。收集從上樣到抽干全過程的洗脫液，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得樣品供試液。HLB柱使用前分別依次用5 mL甲醇、5 mL水、3 mL甲醇活化，并保持柱體濕潤。

1.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：KΙNETEX C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸甲醇，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫：0～5 min，50%A；5～10 min，50%～85%A；10～15 min，85%A；15～16 min，85%～50%A；16～25 min，50%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件ESΙ為正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子噴霧電壓為4 500 V，離子源溫度(TEM)550℃，簾氣(CUR)15 psi，碰撞氣(氮氣)，霧化氣(GS1)55 psi，輔助氣(GS2)55 ps，分析目標(biāo)化合物的去簇電壓(DP)與碰撞能量(CE)值見表1、圖1。

表1 溴甲酚綠與溴百里酚藍的質(zhì)譜分析條件

圖1 溴甲酚綠與溴百里酚藍混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

1.4 方法學(xué)實驗

1.4.1 線性與檢出限取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，配制溴甲酚綠與溴百里酚藍目標(biāo)濃度在0.02～20 μg/mL之間的8個系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進行測定，以目標(biāo)峰峰面積為y，質(zhì)量濃度為x(μg/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至各個化合物最低響應(yīng)色譜峰信噪比(S/N)為3～4的濃度，再以此濃度折算方法檢出限(LOD)。

1.4.2 加樣回收率與精密度取空白的香水、護膚水、啫喱、潔面膏和粉底分別加入50 μL、100 μL、200 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，使低、中、高三個濃度的溴甲酚綠與溴百里酚藍的添加量為約20 mg、40 mg、80 mg/kg，于暗處靜置3 h后按上述前處理方法處理并進樣分析。將回收率按液體、半固體、固體進行分類平均并計算每一類別中總的加標(biāo)回收精密度(RSD%)。

1.4.3 實際樣品檢測選取從海南各市縣市場上采購的各類樣品共54批樣品采用上述前處理方法處理并進樣分析。實際樣品涉及：香水、護膚水、花露水、美白乳膏、防曬霜、育發(fā)液、燙發(fā)液、脫毛膏、洗發(fā)水、洗面奶、面膜、粉底、眼影等類型產(chǎn)品。

2 結(jié)果

2.1 線性與檢出限采用本方法測定化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍的方法檢出限分別為0.82 mg/kg、0.84 mg/kg，可滿足現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗要求，且線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，可用于定量測定。實際標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02～20 μg/mL范圍內(nèi)溴甲酚綠與溴百里酚藍線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 7，但由于增加20 μg/mL濃度點后線性方程的截距均大于0.02 μg/mL濃度的色譜峰響應(yīng)值，因此僅建立0.02～4 μg/mL的線性方程，見表2。

表2 溴甲酚綠與溴百里酚藍的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2 加樣回收率與精密度溴甲酚綠與溴百里酚藍在三大類不同化妝品中平均添加回收率的范圍是98.0%～109%，精密度(RSD%)值均小于6.0%，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，見表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

2.3 實際樣品測試結(jié)果經(jīng)測試共54批不同品牌規(guī)格的實際樣品，結(jié)果未見有基質(zhì)干擾情況，樣品也均未檢出溴甲酚綠與溴百里酚藍。可見目前海南化妝品市場上并未出現(xiàn)溴甲酚綠與溴百里酚藍大規(guī)模濫用情況。

2.4 前處理方法的選擇實驗考察了水、50%甲醇、甲醇、乙腈作為提取溶劑提取樣品時的效果，結(jié)果甲醇效果最佳，且如果使用50%甲醇或水稀釋樣品供試液時，部分樣品會因為輔料的析出而導(dǎo)致溴甲酚綠與溴百里酚藍回收率顯著降低。經(jīng)實驗考察，采用甲醇作為提取溶劑時，以潔面膏為基質(zhì)本底超聲提取20 min溴甲酚綠與溴百里酚藍提取回收率效果最佳，延長時間非但不可提高提取效果，反而會導(dǎo)致回收率降低，見圖2。為保護色譜柱性能，避免不溶物對色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析穩(wěn)定性的影響，樣品前處理時擬采用有機膜過濾樣品供試液。但溴甲酚綠與溴百里酚藍經(jīng)有機膜過濾后會導(dǎo)致回收率顯著降低。經(jīng)測試在0.16 μg/mL濃度時溴百里酚藍用0.45 μm(尼6)有機濾膜棄去8 mL初濾液后回收率方達90%以上，但溴甲酚綠棄去8 mL初濾液質(zhì)譜儀仍無任何響應(yīng)，因此放棄使用有機膜過濾樣品供試液的方案。考慮到有機濾膜過濾會導(dǎo)致目標(biāo)化合物被吸附，離心對部分樣品不適用，因此擬采用固相萃取技術(shù)純化樣品供試液后直接檢測。經(jīng)實驗，當(dāng)HLB固相萃取柱采用甲醇洗滌1 mL時，溴百里酚藍回收率可達90%，溴甲酚綠回收率僅有35%，洗滌3 mL時兩種組分回收率均在95%以上，因此選擇甲醇洗滌3 mL為洗脫條件。

圖2 不同超聲時間提取回收率

2.5 質(zhì)譜與色譜條件的選擇經(jīng)測試甲醇、乙腈、水、甲酸水、乙酸水、乙酸銨水的不同組合，結(jié)果0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水色譜體系色譜峰峰形、分離度相對較好。為了保證實驗的重現(xiàn)性，色譜系統(tǒng)在16～25 min平衡色譜系統(tǒng)9 min。將濃度為20 μg/mL的溴甲酚綠與溴百里酚藍通過蠕動泵與流動相分別注入質(zhì)譜，確定特征離子與去簇電壓、碰撞能量等關(guān)鍵參數(shù)。結(jié)果上述兩種組分均在ESΙ(+)模式下獲得具有較高響應(yīng)的(M+H)+分子離子峰，因此本文選用ESΙ (+)為離子源電離模式，以(M+H)+為分子離子峰進行分析。雖然由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中溴元素的存在，這兩種組分均有較高的同位素響應(yīng)峰，但為了保證待測物的專屬性，本文未選用同位素峰作為定性離子峰，而選擇其他響應(yīng)較強的碎片峰進行定性，本文選定的MRM離子對標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖見圖3。

圖3 溴甲酚綠與溴百里酚藍混合標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖

3 結(jié)論

建立了一種固相萃取結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測化妝品中溴甲酚綠與溴百里酚藍的方法，并采用該方法對5類不同劑型的香水、護膚水、潔面膏、啫喱和粉底等產(chǎn)品進行加標(biāo)實驗和54批從海南各市縣采集的不同來源實際樣品測試實驗。結(jié)果加標(biāo)實驗平均回收率達到98.0%～109%。實際樣品測試結(jié)果均未檢出溴甲酚綠與溴百里酚藍，可見目前海南化妝品市場上尚未出現(xiàn)大規(guī)模違禁添加溴甲酚綠與溴百里酚藍的情況。

綜上所述，本研究建立了一種前處理簡單，檢測速度快，專屬性強，基質(zhì)干擾低，具有很強實用性的溴甲酚綠與溴百里酚藍檢測方法，為針對上述化合物在化妝品中濫用情況的監(jiān)督檢查提供可靠的檢驗依據(jù)。

[1]朱曉敏,張曉軍,何邵衡.化妝品中致接觸性皮炎的過敏原調(diào)查分析[J].中華醫(yī)學(xué)會2009年全國變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文匯編,2009, 150.

[2]González-Mu?oz P,Conde-Salazar L,Va?ó-Galván S.Allergic contact dermatitis caused by cosmetic products[J].Actas Dermo-Sifiliográficas(English Edition),2014,105(9):822-832.

[3]路雪艷,李林峰.香料變應(yīng)性接觸性皮炎[J].中華皮膚科雜志,2006,39(1):56-58.

[4]Qian XY,Liu HS,Zhu XY,et al.Simultaneous determination of 12 synthetic colorants in cosmetics by SPE/UPLC-MS/MS[J].Journal of ΙnstrumentalAnalysis,2014,33(5):527-532

[5]Jia L,Xu W,Liu XN,et al.Determination of 15 colorants in cosmetics by ultra performance liquid chromatography/Tandem mass spectrometry[J].Flavour Fragrance Cosmetics,2013,2(1):36-41.

[6]化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S].中華人民共和國衛(wèi)生部,2007:88.

[7]Regulation(EC)No 1223/2009 of the European Parliament and of the Council of 30 November 2009 on cosmetic products[S].Official Journal of the European Union,2009:191.

[8]Lin WX,Sun XQ,Zhao XR,et al.Simultaneous determination of 6 forbidden colorants in cosmetics by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography,2012,30(5):527-532.

[9]Wang Y,Ma Q,Bai H,et al.Determination of five prohibited coloring agents in cosmetics by HPLC and their verification by HPLC-MS/MS[J].Journal of Ιnstrumental Analysis,2012,31(10): 1288-1293.

[10]Chen J,Jiao H,Ye HY,et al.Determination of 24 Allergens in Suspicious Cosmetics by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Journal of ΙnstrumentalAnalysis,2012,31(3):261-266.

[11]Capitán-Vallvey LF,Valencia MC,Arana Nicolás E.Flow injection analysis with on-line solid phase extraction for spectrophotometric determination of ponceau 4R and its subsidiary unsulfonated dye in sweets and cosmetic products[J].Mikrochimica Acta,2002,138 (1-2):69-76.

Simultaneous determination of bromocresol green and bromothymol blue in cosmetics by high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry.

FU Ce-yi,LIANG Ying,XU Wen-jia,CHEN Chao-man. Laboratory of Cosmetics,Hainan Provincial Institute for Drug Control,Haikou 570216,Hainan,CHINA

ObjectiveTo develop the high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous determination of bromocresol green(BCG)and bromothymol blue(BTB)in cosmetics. MethodsThe cosmetic sample was extracted with methanol under ultrasonication,and separated by HLB solid phase extraction.The extracted complexes were separated on a C18 column(Kinetex C18,2.6 μm,100 A,100×2.10 mm),and identified under electrospray ionization and multiple reactions monitoring(MRM)mode.ResultsThe LODs of BCG and BTB are respectively 0.82 mg/kg and 0.84 mg/kg.Calibration curves were linear in the range of 0.02～4 μg/mL for BCG and BTB,with the correlation coefficients greater than 0.999 5(rBG=1.000 0,rBB=0.999 9).The average recoveries of BCG and BTB in different dosage forms of cosmetics ranged from 98.0%to 109%.ConclusionThe method is simple sensitive and accurate,which adapts to simultaneous determination of BCG and BTB in cosmetics.

HPLC-MS/MS;Cosmetics;Bromocresol green(BCG);Bromothymol blue(BTB)

R446

A

1003—6350（2016）13—2150—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.030

2016-01-21)

符策奕。E-mail：xf_vicar@126.com。