先天性馬蹄內(nèi)翻足與FoxO基因家族的相關(guān)性研究*

程國(guó)杰，艾克巴爾·阿不都熱西提，王晶，王磊（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

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先天性馬蹄內(nèi)翻足與FoxO基因家族的相關(guān)性研究*

程國(guó)杰，艾克巴爾·阿不都熱西提，王晶，王磊
（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

摘要：目的探索先天性馬蹄內(nèi)翻足（ICTEV）與肌肉組織FoxO基因家族（FoxO1、FoxO3和FoxO4）基因表達(dá)的相關(guān)性。方法將2012～2014年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院80例ICTEV患兒及40例健康兒童納入研究，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time-qPCR）和Western blot方法檢測(cè)ICTEV患兒和健康兒童足部肌肉組織FoxO1、FoxO3和FoxO4的基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。結(jié)果①與健康兒童比較，ICTEV患兒肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平存在明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）；FoxO3、FoxO4基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.738）。②ICTEV患兒肌肉組織中FoxO1蛋白表達(dá)量比健康兒童更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）；FoxO3、FoxO4蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.672）。③與漢族ICTEV患兒比較，維吾爾族ICTEV患兒肌肉組織中FoxO1基因轉(zhuǎn)錄水平存在顯著下調(diào)；FoxO3、FoxO4基因轉(zhuǎn)錄水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論ICTEV與FoxO基因家族之間存在相關(guān)性，F(xiàn)oxO1表達(dá)水平的降低可能與ICTEV的發(fā)生有關(guān)，并提示新疆地區(qū)維吾爾族ICTEV患兒更易受FoxO1表達(dá)水平的影響。

關(guān)鍵詞：先天性馬蹄內(nèi)翻足；FoxO基因家族；表達(dá)水平

先天性馬蹄內(nèi)翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重危害兒童健康的先天畸形，由足下垂、內(nèi)翻、內(nèi)收3個(gè)主要畸形綜合而成，我國(guó)ICTEV發(fā)病率約為0.6‰～1.0‰[1]。目前ICTEV病因尚未明確，國(guó)外相關(guān)研究顯示，血管發(fā)育異常可直接影響肌肉及骨骼的發(fā)育，ICTEV發(fā)病可能與幼兒血管發(fā)育異常有關(guān)[2-3]。

FoxO轉(zhuǎn)錄因子屬于Fox家族一員，哺乳動(dòng)物FoxO家族主要包括FoxO1、FoxO3和FoxO4[4]。3種FoxO轉(zhuǎn)錄因子在維持動(dòng)物血管穩(wěn)定和保持造血干細(xì)胞健康發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，基因工程小鼠在缺失FoxO1、FoxO3和FoxO4基因后，會(huì)出現(xiàn)血管?chē)?yán)重畸形現(xiàn)象。基于以上研究成果，本研究對(duì)80例漢族、維吾爾族ICTEV患兒及40例健康兒童的FoxO1、FoxO3和FoxO4基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)數(shù)據(jù)，擬闡明ICTEV與FoxO基因家族的相關(guān)性，以進(jìn)一步明確ICTEV的發(fā)病機(jī)制。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1病例組收集2012～2014年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科收治的80例ICTEV患者組織樣本。其中，維吾爾族58例，漢族22例，且所有患者均符合北京協(xié)和醫(yī)院編寫(xiě)的骨科診療常規(guī)中ICTEV診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2正常對(duì)照組收集同時(shí)期40例維吾爾族和漢族健康兒童組織樣本。其中，維吾爾族15例，漢族25例，且所有組織樣本采集均征得研究對(duì)象的知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)FoxO1、FoxO3和FoxO4在ICTEV患兒和健康兒童肌肉組織中的基因表達(dá)水平

1.2.1總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄運(yùn)用Trizol法提取病例組、正常對(duì)照組肌肉組織的總RNA，溶于焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）。使用美國(guó)Invitrogen公司鼠白血病病毒（moloney′s leukemogenic virus，MLV）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-70℃冰箱冷凍保存、備用。

1.2.2實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）按照美國(guó)Invitrogen公司PlatinumSYBRGreen qPCR Super MIX kit使用說(shuō)明書(shū)加入所需試劑及引物（引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。由于使用2-△△ct相對(duì)定量法（β-actin為內(nèi)參基因），因此每個(gè)樣品的擴(kuò)增效率都需校正。

表1　real-time PCR引物設(shè)計(jì)

1.3Western blot檢測(cè)FoxO1、FoxO3和FoxO4在肌肉組織中的表達(dá)水平

提取病例組、正常對(duì)照組肌肉組織蛋白，并以Bradford法測(cè)定總蛋白量。分別取30μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行封閉。封閉后，首先用經(jīng)1∶500稀釋的鼠抗人FoxO1抗體、鼠抗人FoxO3抗體、鼠抗人FoxO4抗體和鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參）室溫雜交1 h，然后以經(jīng)1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗室溫孵育1 h。條帶經(jīng)Odyssey紅外線(xiàn)熒光掃描后采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況比較

各組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足、雙側(cè)馬蹄內(nèi)翻足的漢族ICTEV患兒與維吾爾族ICTEV患兒比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），見(jiàn)表2。

2.2FoxO1、FoxO3和FoxO4基因在ICTEV患兒和健康兒童肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄情況

ICTEV患兒足部肌肉組織的FoxO1轉(zhuǎn)錄水平低于健康兒童（P=0.021），而兩組FoxO3和FoxO4轉(zhuǎn)錄水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.738）（見(jiàn)圖1）。新疆維吾爾族ICTEV患兒足部肌肉組織的FoxO1轉(zhuǎn)錄水平低于新疆漢族ICTEV患兒（P=0.032），而兩組FoxO3和FoxO4轉(zhuǎn)錄水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.692）（見(jiàn)圖2）。

表2　研究對(duì)象的一般情況（±s）

表2　研究對(duì)象的一般情況（±s）

組別　民族　例數(shù)　年齡/（歲，±s）雙側(cè)馬蹄內(nèi)翻足/例男女單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足/例病例組　漢族　12　10　4.3±5.1　15　7維吾爾族　27　31　4.4±5.9　30　28正常對(duì)照組　漢族　12　13　4.5±6.1　0　0維吾爾族　8　7　4.4±6.2　0　0

圖1　ICTEV患兒和健康兒童足部肌肉組織中FoxO1、FoxO3和FoxO4轉(zhuǎn)錄情況

圖2　新疆維吾爾族和漢族ICTEV患兒足部肌肉組織中FoxO1、FoxO3和FoxO4轉(zhuǎn)錄情況

2.3ICTEV患兒和健康兒童肌肉組織中FoxO1、FoxO3和FoxO4蛋白表達(dá)情況

與健康兒童足部肌肉組織FoxO1蛋白比較，ICTEV患兒足部肌肉組織中FoxO1蛋白表達(dá)量更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.017），兩組FoxO3和FoxO4蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.672）。見(jiàn)圖3、4。

圖3　FoxO1、FoxO3和FoxO4在ICTEV患兒和健康兒童足部肌肉組織中的表達(dá)

圖4　ICTEV患兒和健康兒童足部肌肉組織中FoxO1、FoxO3和FoxO4蛋白表達(dá)情況

3　討論

先天性小兒馬蹄內(nèi)翻足是一種較為常見(jiàn)的先天畸形，患兒一出生即在神經(jīng)、肌肉、骨骼及軟骨等方面表現(xiàn)出病理變化，且難以矯正。雖然小兒馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)研究已近1個(gè)世紀(jì)，但具體病因仍未明確[6-7]，僅提示遺傳、環(huán)境、毒性物質(zhì)、易感基因等因素可能影響胚胎發(fā)育而導(dǎo)致馬蹄內(nèi)翻足[8-10]。因此，加強(qiáng)ICTEV致病機(jī)制的研究，是有效防范小兒先天畸形的重要手段。

FoxO基因家族是一類(lèi)DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能通過(guò)招募共激活因子等調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，還能直接同凝聚染色質(zhì)結(jié)合而參與其重構(gòu)，協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，其在胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、維持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。國(guó)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，缺失FoxO基因家族FoxO1、FoxO3和FoxO4基因的實(shí)驗(yàn)小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的血管畸形現(xiàn)象。本研究結(jié)合ICTEV中血管畸形病變，可提示FoxO基因家族可能在ICTEV致病過(guò)程中發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)80例漢族、維吾爾族ICTEV患兒及40例健康兒童足部肌肉組織FoxO1、FoxO3和FoxO4基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ICTEV患兒的FoxO1基因較健康兒童下降，其中維吾爾族ICTEV患兒FoxO1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平低于漢族ICTEV患兒；ICTEV患兒FoxO3、FoxO4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與健康兒童比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FoxO1作為眾多傳導(dǎo)通路中的重要交叉點(diǎn)，除參與細(xì)胞凋亡、DNA損傷與修復(fù)、骨代謝、腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng)外，也與血管形成密切相關(guān)[14-15]，2014年10月，德國(guó)Max Planck Institute研究所發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可以調(diào)節(jié)血管壁中細(xì)胞的分裂。先天性小兒馬蹄內(nèi)翻足的發(fā)病，同樣伴隨著血管畸形的病理變化，該變化與本研究結(jié)果結(jié)合，可進(jìn)一步明確FoxO1與ICTEV的發(fā)病具有相關(guān)性，并初步推論為FoxO1通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的調(diào)控，影響血管的穩(wěn)定，從而進(jìn)一步引起ICTEV的發(fā)病。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)FoxO3、FoxO4在ICTEV患兒與健康兒童中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果或許能推測(cè)ICTEV的血管畸形主要通過(guò)FoxO1低表達(dá)予以實(shí)現(xiàn)。不同種族的先天性小兒馬蹄內(nèi)翻足的發(fā)病率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從0.65‰～7.00‰，在新疆，ICTEV以維吾爾族兒童發(fā)病率為最高，本研究中，新疆維吾爾族ICTEV患兒FoxO1基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平比健康兒童和漢族ICTEV患兒都低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果提示新疆維吾爾族ICTEV兒童更容易受FoxO1水平變化的影響。

綜上所述，ICTEV的致病原因是復(fù)雜且多樣的，F(xiàn)oxO1基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的變化作為引起ICTEV發(fā)病的一種可能，將會(huì)成為未來(lái)研究ICTEV致病的重要方向。其中FoxO1受何種信號(hào)通路的調(diào)控以及是否自身基因突變等原因，而引發(fā)表達(dá)水平發(fā)生變化，都有待研究驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]易玲,周光萱,代禮,等. 2001～2010年中國(guó)先天性馬蹄內(nèi)翻足的流行病學(xué)分析[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2013, 44(4): 606-609.

[2] Werler MM, Yazdy MM, Mitchell AA, et al. Descriptive epidemiology of idiopathic clubfoot[J]. Am J Med Genet A, 2013, 161(7): 1569-1578.

[3] Parker SE, Mai CT, Strickland MJ, et al. Multistate study of the epidemiology of clubfoot[J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2009, 85(11): 897-904.

[4]黃寧,李文佳,安利國(guó),等. FoxO1的功能及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系[J].生命科學(xué), 2012, 24(4): 334-338.

[5]關(guān)尚一. FoxO轉(zhuǎn)錄因子在運(yùn)動(dòng)骨骼肌領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].運(yùn)動(dòng)人體科學(xué), 2013, 3(24): 22-24.

[6]司曉鳳,葉嬌,王玉輝,等.先天性馬蹄內(nèi)翻足病因的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 16(3): 181-184.

[7]劉衛(wèi)勇,際亞青,趙黎,等.小兒先天性馬蹄內(nèi)翻足小腿肌肉超聲改變[J].中華醫(yī)學(xué)超聲雜志:電子版, 2010, 7(6): 982-990.

[8]杜香平,吳欣樂(lè),余麗蓉,等. Pitxl基因突變與先天性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性研究[J].中華小兒外科雜志, 2013, 34(6): 443-446.

[9]趙寧,金春蓮,劉麗英,等. COL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列變異與單純性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2010,26(4):433-435.

[10]曹東華,王謙,林長(zhǎng)坤,等. Gli3、EN1基因在單純性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)生中的功能研究[J].遺傳, 2009, 12(31): 1214-1220.

[11]朱宇勝,張勇,李艷,等. FoxO轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控及其對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2013, 25(4): 677-684.

[12] Nakae J, Kitamura T, Kitamura Y, et al. The forkhead transcription factor FoxO1 regulates adipocyte differentiation[J]. Dev Cell, 2003, 4(1): 119-129.

[13] Greer EL, Brunet A. FoxO transcription factors at the interface between longevity and tumor suppression[J]. Oncogene, 2005, 24(50): 7410-7425.

[14] Sykes SM, Lane SW, Bullinger L, et al. AKT/FoxO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias[J]. Cell, 2011, 146(5): 697-708.

[15] Williams TM, Williams ME. Candidate downstream regulated genes of HOX group 13 transcription factors with and without monomeric DNA binding capability[J]. Dev Biol, 2005, 279(2): 462-480.

（申海菊編輯）

Association between idiopathic congenital talipes equinovarus and FoxO gene family*

Guo-jie Cheng, A-budurexiti·Aikebare, Jing Wang, Lei Wang
(The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830000, China)

Abstract:Objective To study the association between idiopathic congenital talipe equinovarus (ICTEV) and FoxO gene family (FoxO1, FoxO3 and FoxO4). Methods A total of 80 ICTEV patients and 40 normal controls were collected in the Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University between 2012 and 2014. The RT-PCR and Western blot were performed to evaluate the levels of mRNA and protein of FoxO1, FoxO3 and FoxO4 from ICTEV patients and normal controls. Results Compared with the normal controls, the ICTEV patients showed down-regulation of FoxO1 gene in transcription (P= 0.021). However there was no difference in FoxO3 or FoxO4 (P= 0.738). Western blot showed that FoxO1 protein was down-regulated in muscular tissue of the ICTEV patients (P = 0.017), neither FoxO3 nor FoxO4 protein level had significant difference (P = 0.672). Compared with the Han ICTEV patients, the Uygur ICTEV patients showed down-regulation of FoxO1 gene in transcription (P＜0.05), but there was no difference in FoxO3 or FoxO4(P＞0.05). Conclusions There is a significant correlation between ICTEV and FoxO gene family. The low expression level of FoxO1 could lead to the occurrence of ICTEV. In addition, these results indicated that the Uygur ICTEV patients are prone to be influenced by the expression level of FoxO1.

Keywords:idiopathic congenital talipes equinovarus; FoxO gene family; expression level

[通信作者]艾克巴爾·阿不都熱西提，E-mail：king-2032169@163.com

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81160215）

收稿日期：2015-10-30

文章編號(hào)：1005-8982（2016）03-0014-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.003

中圖分類(lèi)號(hào)：R726.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A