熒光染色法在檢測痰中結核桿菌的應用分析

張國斌

熒光染色法在檢測痰中結核桿菌的應用分析

張國斌

目的探討熒光染色法在檢測痰中結核桿菌的應用價值。方法80例確診的肺結核患者,均經深咯痰標本的收集,制作兩份痰標本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對結核分枝桿菌進行檢測,比較兩種檢測方法的檢測陽性率。結果采用熒光染色法檢測結核桿菌的陽性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差異有統計學意義(P＜0.05)。熒光染色法檢測結核桿菌+、++、+++、++++的陽性率高于抗酸染色法,但差異無統計學意義(P＞0.05)。結論熒光染色法對結核分枝桿菌的診斷率較高,而且方便、快捷,對于肺結核的診斷具有重要意義。

熒光染色法；痰液；結核桿菌

結核病是一種慢性疾病,由結核桿菌感染所引起,主要通過呼吸道傳播,屬于人類重大的傳染病之一。21世紀以來全球每年約出現800萬結核新病例,約300萬人死亡。我國的結核病流行情況較為嚴重,同時患者的耐結核藥情況也比較嚴重。絕大多數結核病都是可以治愈的,早期診斷、發現傳染源對確定治療方案,改善患者預后具有積極意義。目前,臨床上對結核病的診斷,主要是通過痰涂片鏡下檢查、病理切片、X線以及細菌培養等。如何快速有效的檢查分枝桿菌細菌,發現傳染源是檢驗科值得研究的課題。據相關研究報道,在常見的幾種結核病檢測手段中,熒光染色試驗診斷結核桿菌的陽性率較高［1］。本研究選取本院2015年8月～2016年2月收治的80例確診的肺結核患者為研究對象,比較熒光染色法與抗酸法的診斷情況,現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年8月～2016年2月收治的80例確診的肺結核患者,符合肺結核診斷標準［2］,診斷為活動性肺結核。其中男44例,女36例,年齡21～75歲,平均年齡(45.9±16.2)歲。

1.2方法 收集患者的一般資料,如臨床癥狀、體征、X線、PPD試驗、結核抗體檢查、血常規、血生化等檢驗結果。每例患者均經深咯痰標本的收集,制作兩份痰標本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對結核分枝桿菌進行檢測。留取患者清晨痰。用生理鹽水漱口后,以清除口腔內的食物殘渣及部分雜菌,第一口痰棄去,取深部咳痰三口,合格標本量≥1 ml。將收集到的痰液放入無菌塑料標本盒中,勿將唾液或鼻涕吐入標本盒。將收集到的痰液放置于無菌的密封瓶中,檢測前進行相關處理,將一定劑量的胰酶消化液注入到痰液中,進行水浴消化,增強消化效應。之后加入一定劑量的氫氧化鈉,采用振蕩器混勻,混合10 min。檢測時取處理后的痰液標本0.5～0.8 ml,倒入潔凈離心試管中以3000 r/min的速度進行離心,時間為10 min。離心處理后選擇沉淀部分,取0.1 ml置于載玻片中央處,并均勻涂抹成1.0 cm×2.0 cm橢圓形痰膜,薄厚適中,讓其自然干燥后痰涂片火焰固定,置于染色架上。每份痰液制作兩份痰標本玻片后分別采用抗酸染色法和免疫熒光法對結核分枝桿菌進行檢測。①熒光染色法：首先經制作好的痰涂片放入濕盒中,水洗后用5%的鹽酸乙醇脫色1～2 min,外觀無黃色為止,水洗。將痰涂片利用熒光素標記抗結核桿菌單克隆抗體對待檢的標本進行染色,在LED熒光顯微鏡下,把物鏡焦距調為40×,對結核分枝桿菌的情況進行觀察。②抗酸染色法：按《結核病診斷細菌學檢驗規程》的常規操作方法對結核分枝桿菌的情況進行檢查,滴加復紅染色劑后加熱,出現蒸汽后,3～5 min后水洗。然后使用鹽酸乙醇將其脫色,時間控制在10 min以內。脫色后水洗,加亞甲藍復染30 s,水洗,室溫下待干。

1.3觀察指標及評定標準 比較抗酸染色法和免疫熒光法對結核分枝桿菌的診斷陽性率。其中抗酸染色標本中分枝桿菌呈紅色,其他細胞核細菌呈藍色。20倍熒光顯微鏡下,分枝桿菌呈黃綠色,40倍下可觀察到分枝桿菌呈桿狀或棒狀。根據檢測結果的不同分為陰性(-)、+、++、+++、++++,兩者均以《結核病診斷實驗室檢驗規程》為準。熒光染色抗酸桿菌陰性(-)［3］：每50視野符合0條；熒光染色抗酸桿菌陽性(+)：每50視野有10～99條；熒光染色抗酸桿菌陽性(++)：每個視野符合1～9條；熒光染色抗酸桿菌陽性(+++)：每個視野符合10～99條；熒光染色抗酸桿菌陽性(++++)：每個視野符合≥100條。抗酸桿菌陰性(-)：連續觀察300個不同視野,符合0條/300；抗酸桿菌陽性(+)：每100視野符合3～9條；抗酸桿菌陽性(++)；每10視野符合1～9條；抗酸桿菌陽性(+++)：每視野符合1～9條；抗酸桿菌陽性(++++)：每視野符合≥10條。對兩種檢測方法的檢測陽性率進行比較。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件處理數據。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

采用熒光染色法檢測結核桿菌的陽性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差異有統計學意義(P＜0.05)。熒光染色法檢測結核桿菌+、++、+++、++++的陽性率高于抗酸染色法,但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 熒光染色法與抗酸染色法檢測結核桿菌的陽性率比較［n(%)］

3 討論

肺結核是一個全球公共衛生和社會問題,其病理基礎不十分清楚,具有病程長、傳染性強的特點。我國的肺結核發病率于近年來有逐漸上升的趨勢,面臨著較為嚴峻的局面。對疾病的控制首先面臨的問題是結核病的診斷。早期應用快捷靈敏的實驗室診斷方法以及發現和治療肺結核是該疾病控制的關鍵。結核桿菌屬于放線菌目,可侵犯人體的各組織和器官,其中以肺部最為常見［4］。結核桿菌是肺結核的致病菌,早在1882年就由德國細菌學家郭霍所證明。結核桿菌的細胞壁中含有較多脂質,約占細胞干重的60%。細胞染色法成為檢測該種桿菌細胞的常用方法。抗酸染色法是全世界結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢查方法,該方法操作簡單,但檢測時間長,而且難以準確反映痰液當中攜帶的細菌數目,陽性率低,靈敏度和特異性也較差,而且檢測結果受標本質量的影響較大［5］。病理檢測的準確性高,但細菌培養的特異性和敏感性較低,而且耗時長,在臨床早期應用上受到了限制。

隨著結核病的分子生物學診斷技術的迅速發展,熒光染色法在結核桿菌的診斷中逐漸推廣起來。熒光染色法所檢測的是結核分枝桿菌的特異DNA片段,熒光顯微鏡下觀察呈現特異性熒光成像,與藍黑色背景反差很大,對比鮮明,非常明顯容易被發現［6］。該方法檢測既不需要進行細菌的培養,也不需要菌體是否有活力,具有操作簡單、結果可靠、可定量、靈敏度、重復性和特異性好等特點。而且熒光染色的檢測結果在熒光顯微鏡下進行,可觀察的范圍更廣,更容易進行結果的判讀。本研究將熒光染色和抗酸染色對結核桿菌檢測的陽性率進行比較,結果發現,熒光法檢測的陽性率顯著高于抗酸染色,差異有統計學意義(P＜0.05)。而且有研究顯示,對疑似結核病的患者進行熒光染色法檢測的陽性率也高于抗酸染色法［7］,且熒光染色法的檢查靈敏度更高,可為疾病診斷提供較科學的檢測依據。

綜上所述,熒光染色法對結核分枝桿菌的診斷率較高,而且方便、快捷,對于肺結核的診斷具有重要意義。

［1］張東浩,李影.熒光定量PCR檢測痰結核分枝桿菌DNA的應用價值.中國醫藥指南,2012,10(1):90-91.

［2］陳文彬,潘祥林.診斷學.第7 版.北京:人民衛生出版社,2008: 27.

［3］趙志英,劉振波.不同檢測方法對痰液標本中結核桿菌檢測效果的比較分析.中外健康文摘,2013,10(18):137-138.

［4］丁瑤,葉琴.金胺O熒光染色法應用效果評價.中國保健營養,2015,25(13):151.

［5］張立,周洪經,馮爽.熒光染色法在結核分枝桿菌檢測中的應用.山東醫藥,2014,54(7):55-57.

［6］楊江華,朱曉玥,王文節.免疫熒光染色法檢測結核分支桿菌的建立與臨床應用.中國實驗診斷學,2015,19(5):775-777.

［7］肖靜,楊元好,金瑛.熒光染色法檢測痰中結核桿菌的應用.貴陽中醫學院學報,2013,35(4):152-153.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.008

2016-07-22］

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