乙酰葛根素對氧糖剝離致神經元損傷的干預作用

李 蘭 劉東梅

安徽醫學高等專科學校護理學部 安徽合肥 230601

乙酰葛根素對氧糖剝離致神經元損傷的干預作用

李 蘭 劉東梅

安徽醫學高等專科學校護理學部 安徽合肥 230601

本文主要通過三組實驗來研究乙酰葛根素氧糖剝離對神經細胞損傷的干預作用。研究方法在氧糖剝離的基礎上建立細胞模型；利用6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）法觀察神經細胞的凋亡率；利用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測細胞核因子（或稱為K基因結合核因子）、蛋白質（HIF-1α）以及P53基因的表達；利用蛋白印跡法或免疫印跡的實驗方法測定熱休克蛋白70（Hsp70）的含量以及三種不同濃度的乙酰葛根素對熱休克蛋白70的影響。

乙酰葛根素；氧糖剝離；熱休克蛋白

腦中風又被稱為腦卒中或腦血管意外是一種急發的高死亡率的病癥，病因是腦部血液循環障礙而引起的大腦局部功能缺失導致細胞死亡，其細胞的死亡有凋亡和壞死這兩種形式。缺血性腦中風中心區的細胞死亡是由細胞壞死導致的，而中心區周圍的細胞死亡是由細胞凋亡而導致的[1]。凋亡的細胞，如果不及時供血一般在數小時或幾周內將會死亡，如果供血及時凋亡的細胞會因血供恢復而得到復蘇。因此，如果能研制出具有保護腦缺血功能的藥物就能夠有效降低缺血導致的神經元的凋亡率，從而降低因腦中風而導致的死亡率[2-3]。乙酰葛根素是對葛根中提煉出的葛根素進行改造化學結構引入側鏈后得到的一種新型異黃酮類化合物其結構，相對葛根素其脂溶性增加，透過血腦屏障的能力明顯提高。

實驗中，我們采用國內外常用的體外氧糖剝離模型，研究乙酰葛根素對胎鼠海馬神經細胞凋亡起到的保護作用，并對影響機制進行探討。

1 實驗方法

1.1 進行胎鼠海馬神經細胞的培養

完全培養液為神經基質培養基（NB）、1.2摩爾/L的谷酰胺、蛋白基因B27（20 ml·）、青霉素（50 k U·）以及鏈霉素（50 mg·）。試驗開始后間隔3天換一次溶液，到第7天或者第八天開始后續實驗。每組實驗均需重復 3 次，所用胎鼠海馬神經細胞要來自于 3 只不同的孕鼠。

1.2 氧糖剝奪及分組

正常對照組：換成含糖酚紅液，置入二氧化碳培養箱，三小時后換成神經基質培養基完全培養液孵育（不含蛋白基因）。氧糖剝奪/R-24 h 組：最先將無糖酚紅液滴入厭氧培養箱中半小時，氧的濃度保持低于1%。用無糖酚紅液對細胞進行4次清洗，每次使用的無糖酚紅液為原培養液體積的 2/3，葡萄糖的濃度保持低于1摩爾/L。細胞在厭氧罐內放置三小時后換神經基質培養基完全培養液（不含蛋白基因），然后放入二氧化碳培養箱內繼續進行一天的孵育。藥物處理組：在換無糖酚紅液及氧糖剝奪結束后換成神經基質培養基完全培養液（不含不含蛋白基因）時，分別在三組胎鼠中加入低、中、高不同濃度濃度的乙酰葛根素，低濃度為 0.1摩爾/L、中濃度為0.4摩爾/L、高濃度為1.6摩爾/L，其余處置同上。

1.3 6-聯脒-2-苯基吲哚檢測

加入 2.5摩爾/L的6-聯脒-2-苯基吲哚染料，使用熒光顯微鏡進行觀察。如果染色較亮，染色質濃縮，甚至出現碎裂的細胞就是凋亡樣的陽性細胞。凋亡細胞的計算方法在顯微鏡觀測下隨機所選取5個陽性細胞數占總計數的百分率。

1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

實驗過程可參照試劑盒的說明進行。結果采用阿爾法緩解俱樂部軟件進行分析，用目標產物與肌動蛋白的光密度比值來表示各組信使核糖酸的水平。

1.5 利用免疫印跡法使神經細胞經RIPA裂解，

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后在半干狀態下轉運至聚偏氟乙烯膜上，加熱激蛋白70山羊抗一抗（1∶400），過夜溫度保持在4℃，加入二抗（1∶5000），利用化學發光法使其顯色。

2 ．結果

2.1 乙酰葛根素對氧糖剝離/R-24 h 導致的細胞凋亡率的影響

氧糖剝奪的海馬神經細胞顯示有凋亡細胞的出現，試驗中采用低濃度0.1摩爾/L、中濃度0.4摩爾/L、高濃度為1.6摩爾/L的乙酰葛根素，低濃度的乙酰葛根素使凋亡的陽性細胞的數目降至63.01% ±7.35%、中濃度的將至 59.06% ±5.98%、高濃度的將至 51.05% ±5.98%。根據三次實驗結果顯示出中和高濃度的乙酰葛根素對氧糖剝奪/R-24 h導致的神經細胞有保護作用（P＜ 0.05）。

2．2 乙酰葛根素對氧糖剝奪/R-24 h 所致的核轉錄因子、缺氧誘導因子以及p53信使核糖酸表達的影響

核轉錄因子在腦細胞缺血以及再灌注中的具體作用還存有異議。在本次實驗中，不同濃度的乙酰葛根素可以使已經升高的核轉錄因子以及信使DNA降低。缺氧誘導因子以及信使核糖酸在海馬神經細胞的凋亡中發揮著至關重要的作用，乙酰葛根素可使氧糖剝奪/R-24 h 后升高的缺氧誘導因子及p53信使核糖酸水平降低。

2.3 乙酰葛根素對氧糖剝奪/R-24h所致熱休克蛋白70表達的影響

熱休克蛋白70是一種高度保守的蛋白，會隨著腦細胞缺血而升高，能夠對受損海馬細胞起到保護作用。為了觀測乙酰葛根素的神經細胞保護作用是否會關系到熱休克蛋白70的改變，我們通過蛋白質印跡法檢測了各組胎鼠海馬神經細胞熱休克蛋白70 的表達。氧糖剝奪/R-24 h后熱休克蛋白70的表達值保持在0.23±0.08，分別加入低、中、高濃度的乙酰葛根素后，對應的表達值為低濃度0.49±0.16、中濃度0.73±0.08、高濃度1.11±0.24，加入前后具有顯著的差異。

通過對三組胎鼠海馬神經細胞的實驗，可得出以下結論 不同濃度的乙酰葛根素能夠使熱休克蛋白70有很明顯的升高，能夠增強機體海馬神經元對缺血損傷的抵抗能力。綜上所述，乙酰葛根素對體外氧糖剝離的神經細胞具有保護作用，保護機制涉及到相關凋亡因子的改變。

[1]宋修云，胡金風，陳乃宏．神經細胞凋亡與腦缺血疾病［J］．中國藥理學通報，2012，28（3）：307 - 10．

R285.5

A

1672-5018（2016）07-037-01

安徽省高校自然科學研究一般項目（編號：12925KJ2015B06）