組蛋白去乙酰化酶在軟骨發育和骨關節炎中的作用

魯經緯，章 磊，樊根濤綜述， 趙建寧審校

·綜 述·

組蛋白去乙酰化酶在軟骨發育和骨關節炎中的作用

魯經緯，章 磊，樊根濤綜述， 趙建寧審校

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)能使染色質結構更加緊密從而起到轉錄抑制的作用。一些研究結果表明HDACs與病變軟骨的相關基因表達和骨關節炎(OA)進展有關。本文總結了OA和軟骨發育研究領域HDACs相關的研究成果，以期更深入的了解OA的發病機制以及為OA的治療方案提供新的思路。

骨關節炎；組蛋白去乙酰化酶；軟骨發育

骨關節炎(OA)的病因尚不明確，其發生與肥胖、年齡、炎癥、創傷、遺傳等因素有關[1-2]。近年來，隨著對OA研究的不斷深入，發現了一種特別的遺傳調控機制在OA的發生發展中起了重要作用，這種機制的研究被稱為表觀遺傳學。表觀遺傳是指不涉及基因序列變化而通過轉錄調控影響生物表型的一種遺傳模式[3-4]。在遺傳學諸多分子作用基礎中,組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾占據重要地位。真核生物的脫氧核糖核酸(DNA)在核小體中包裹于組蛋白八聚體之上,組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)是維持組蛋白乙酰化平衡的兩種關鍵酶類之一[另一種為組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)]，其催化組蛋白的去乙酰化作用，使染色質結構更加緊密，對基因轉錄起到抑制作用[5]。

1 組蛋白去乙酰化酶

1.1 分類 HDACs被分為兩個家族:經典組蛋白去乙酰化酶(HDAC)家族和沉默信息調節因子2(silent information regulator2，Sir2)-相關酶類家族(即HDACIII類)。基于酵母種系發育中的不同HDACs的結構同源性分析，經典HDAC家族又可分為三類：與酵母RPD3基因同源的HDAC I類(包括HDAC1、2、3、8)，與酵母HDA1基因同源的II類(包括HDAC4、5、6、7、9、10)以及HDAC11獨自代表的Ⅳ類[6]。

1.2 大小和定位 人類自身編碼經典HDAC家族的11種HDAC，其中I類HDAC大約由400-500種氨基酸組成，位于細胞核內，幾乎可以在所有類型的細胞中普遍表達。II類HDAC的大小大約是I類HDAC的兩倍(約由1000個氨基酸組成)，在特定的細胞信號引導下可以在細胞質與細胞核之間穿梭。II類HDAC與I類HDAC的另一個不同點是，它們的表達具有一定的細胞和組織特異性，這點提示其可能參與了細胞的分化和發育過程。IV類HDAC存在于細胞核中,相較于II類HDAC，其結構更接近于I類HDAC。

1.3 作用機制 在體內，所有的核心組蛋白都處于乙酰化狀態，HDACs能夠移除組蛋白的乙酰基，低乙酰化狀態可以使組蛋白與包繞在其周圍的DNA之間的空間變小。纏繞更緊密的DNA使轉錄因子難于與其結合，達到轉錄抑制的作用[7-8]。

2 HDACs與軟骨發育

2.1 調控細胞外基因 軟骨細胞可合成分泌軟骨特有的細胞外基質,如蛋白聚糖,II型膠原等。相關研究[9]發現，轉錄因子Snail通過與HDAC1和HDAC2的羧基末端功能區相互作用，抑制軟骨細胞中II型膠原的表達。在體外培養的軟骨細胞中對HDAC的活性進行抑制,II型膠原表達量亦會降低[10]，這種現象可能是由于HDAC抑制了Wnt-5a 基因的轉錄，后者具有抑制II型膠原表達的作用。這些報道說明了HDACs通過調節軟骨相關的轉錄因子影響軟骨的自穩態。軟骨細胞由滑膜間充質干細胞(synovium-derived stem cells，SDSCs)分化而來， Pei 等[11]研究發現，對未用轉錄生長因子TGF-β2干預的SDSCs，超表達的HDAC4對軟骨形成作用沒有影響；而對使用了TGF-β2干預的SDSCs，超表達的HDAC4能夠加快軟骨形成的速度并將其維持在一個較高的水平，且與此同時下調了肥大軟骨細胞的標志物—X型膠原的表達。以上結果表明HDAC4具有促進并維持TGF-β2誘導的軟骨形成的作用，啟示不只生長因子本身能夠影響軟骨形成，對其轉錄水平上的調節對軟骨形成也有重要影響。

2.2 調控軟骨細胞 在胚胎發育過程中，間充質干細胞增殖分化形成軟骨板，經由軟骨內成骨生成骨骼[12]。此過程中軟骨細胞經歷肥大化，并分泌細胞外基質。Runx2基因是軟骨細胞肥大過程中必須的轉錄因子，HDAC4在軟骨前肥大細胞中表達,通過與Runx2基因相互作用，通過抑制Runx2的表達活性調控軟骨細胞的肥大和軟骨內成骨[13]。敲除HDAC4基因的小鼠在骨骼發育過程中由于肋軟骨細胞肥大化時間的提前，表現出不成熟的骨化，致使胸廓發育畸形，呼吸受限，在出生1周內就會死亡[14]。可見在軟骨形成過程中，HDAC4作為調控軟骨細胞肥大的關鍵因子。軟骨細胞不僅受到HDAC4表達量高低的影響，也受到HDAC4定位不同的影響，HDAC4從細胞核轉移到細胞質這一重新定位的過程能促進軟骨細胞由增殖期向到前肥大期過渡[15]。I類HDACs中的HDAC3對軟骨細胞肥大也有重要調節作用[16]。

3 HDACs與OA

金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一類共同作用導致細胞外基質降解的酶類。對于一些正常的生理過程如生長發育和傷口愈合，低濃度的MMP起著重要的作用。在OA中，MMP表達異常增多，導致軟骨基質發生不可逆的降解，最終發展到關節破壞。金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase-13，MMP-13)是軟骨細胞外基質重要的降解酶，其水解II型膠原的作用較之其他MMP更強。動物實驗及體外培養實驗也表明MMP-13在OA的病理過程中起著重要作用[17-18]。MMP-13由軟骨細胞分泌，晚期OA患者的關節軟骨中MMP-13的表達量比早期OA患者或者正常人的關節軟骨中MMP-13的表達量高出許多[18]。在人OA軟骨檢測到HDAC7比其在正常軟骨中的表達量顯著增高，為了探討HDAC7的表達增高是否和MMP-13的表達增高有關， Higashiyama等[19]采用人軟骨肉瘤細胞系——sw1353細胞，加入小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)對HDAC7進行基因沉默，使用實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應(real time RT-PCR)方法測定MMP-13的表達量，在對照組和使用白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)誘導組，HDAC7基因沉默均使MMP-13的表達量顯著降低，這一結果提示在OA病理中HDAC7促進了MMP-13的表達，對HDAC7在OA發病中的作用有了進一步的認識。除了II類HDACs中的HDAC7，I類HDACs中的HDAC1和HDAC2在OA軟骨細胞中的表達也是升高的，伴隨它們的升高，一些軟骨特異性基因如蛋白聚糖、II型膠原的表達受到了抑制[9]。這提示HDAC1和HDAC2可能在OA關節的軟骨退化中起到了一定的作用，然而其具體機制還有待進一步闡明。

4 組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)與OA

為了探究HDACs在OA中的作用，組蛋白去乙酰化酶抑制劑在OA研究領域被廣泛應用。在軟骨外植體培養中，HDACi能夠抑制細胞因子誘導的蛋白聚糖的釋放和軟骨的吸收[20-21],提示HDACs的活性對軟骨細胞的分解代謝作用有影響。在體外實驗中，HDACi能夠抑制誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)和環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的蛋白質生產[20]以及MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5( a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type 5motifs，V型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶)、ADAMTS-9基因轉錄[21]。這些結果表明HDACi能夠抑制軟骨基質降解酶的表達，提示HDACi具有用于治療OA的潛力。受此啟發，有研究者在OA模型兔子的關節腔內注射一種廣譜HDACi——曲古抑菌素(trichostatin，TSA)，相較對照組，注射TSA組的關節軟骨退化程度更輕且炎癥因子IL-1和基質降解酶的表達均降低[22]。更具特異性的HDACi也在軟骨相關研究中得到了應用，如苯甲酰胺MS-275，其被證明對I類HDACs具有選擇特異性，能夠抑制HDAC1、2和3的活性而不對HDAC8產生抑制作用[23-24]。在體外實驗中，使用苯甲酰胺MS-275對HDAC1、2和3進行抑制，軟骨細胞的基質降解酶降低，軟骨的吸收亦受到抑制[23]。可見I類HDACs，尤其是HDAC1、2和3是潛在的治療OA的靶點。

HDACi能夠抑制軟骨細胞中細胞因子誘導的金屬蛋白酶的表達[25]，然而，有研究發現HDACi能夠提高IL-1刺激的MMP-1和MMP-13啟動子提高組蛋白H4的乙酰化程度[26]，提示不依賴組蛋白抑制機制的存在。HDACi作用時間長短的不同也會導致不同的效果。作用時間較短(<24 h)時，軟骨細胞合成代謝的相關基因如II型膠原、IX型膠原、軟骨寡聚蛋白質、蛋白聚糖表達增高，而在作用時間延長的情況下，上述基因的表達受到抑制。在腫瘤的治療研究中，HDACi藥物已經進入臨床試驗階段[27]。在動物模型中，一些HDACi表現出對類風濕關節炎的治療效果。OA研究領域對HDACi的研究現在主要處于體外實驗的階段，有待進一步深入。

5 結論和展望

表觀遺傳學的研究不斷深入為對OA病理的理解提供了新的視角，相較其他組織，OA的表觀遺傳研究的一大優勢就是軟骨所含細胞種類只有一種[28]。以上研究結果表明了組蛋白去乙酰化酶在軟骨形成以及OA的發生發展中起了重要的作用。越來越多HDACs與軟骨發育以及OA相關的研究為更好的了解OA的發病機制提供了新的視角。當然，這些實驗中也存在一些尚待完善之處：①采用的HDACi多為廣譜，無法明確軟骨相關基因表達變化歸因于何種HDAC。對HDAC具有特異性、選擇性抑制作用的HDACi仍需進一步研究與應用；②通過HDAC表達量的測定對HDAC的活性變化進行判斷。然而表達量與活性是否為正相關或者線性關系，并未給予驗證，因此HDAC經典家族中各HDAC在OA病理過程中的活性變化有待進一步實驗驗證；③體內試驗尚較缺乏。模式動物需要更多的應用到相關研究當中，從而更好地模擬HDAC在人類軟骨中的作用效果。在傳統治療方法無法阻止OA病情進展的現狀下，以HDACs作為靶點的治療藥物值得進一步研究。HDACi在動物實驗中對OA的治療初見成效，更多的體內試驗及臨床試驗令人期待。

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(本文編輯：黃攸生)

南京軍區南京總醫院管理課題資助項目(2016008)

210002 江蘇南京，南京軍區南京總醫院骨科

趙建寧，E-mail：zhaojianning.0207@163.com

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10.3969/j.issn.1672-271X.2016.06.021

2016-07-26；

2016-10-19)