酪蛋白抗凝血肽的分離純化及其抗凝血活性測定

劉麗莎，苗艷麗,陳紹紅,張劉，盧曉

(1.廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)，又稱循環系統疾病，這類疾病居全球死亡率首位，預計到2030年將會有超過2 360萬人死于心血管疾病[1-2]。血栓類疾病是典型的心血管疾病，具有高發病率、高死亡率、高致殘率及并發癥多等特點。抗凝治療是預防和治療血栓類疾病的主要手段，目前用于治療該類疾病的藥物有很多，主要有肝素、華法林及阿加曲班等，但這些藥物都存在一定的副作用，例如引起血小板減少、出血及骨質疏松等，有待進一步發展與完善。

目前，一些食源性蛋白水解、發酵等產物已被證實具有抗凝血活性，如魚皮蛋白水解物[3]、豆類蛋白水解物[4]、酪蛋白水解物[5]及貽貝、魚肉蛋白水解物[6-7]等，部分活性肽結構已經得到解析。進而，從食物源中深入研究開發具有抗凝血功能的肽類具有廣泛的前景。同時，食源性生物活性肽憑借其吸收性好[8]、副作用小[9]等優點日益受到研究者的重視，其主要來源為乳類蛋白，蛋清蛋白及水產蛋白等。

本實驗以酪蛋白為原料，通過菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶4種酶復合酶解酪蛋白獲得具有抗凝血活性的小肽[10]，然后采用超濾法初步分離得到純度較高的抗凝血肽，并利用凝膠色譜法確定其分子量分布。本研究目的在于，以酪蛋白為原料來制備酪蛋白抗凝血肽，研發能夠防治血栓性疾病的食源性生物活性肽類藥物或具有保健功能的食品，并為這方面的研究提供一定的實驗基礎和理論依據。

1 實驗材料和儀器

新西蘭大白兔，兩只，雌雄各半，普通級，質量2.3～2.5 kg,廣東省醫學動物實驗中心，生產證號:SCXX(粵)2017-0035。酪蛋白(上海源葉生物科技有限公司)；胰蛋白酶250 U·mg-1、木瓜蛋白酶800 U·mg-1、菠蘿蛋白酶300 U·mg-1、中性蛋白酶100 U·mg-1(上海源葉生物科技有限公司);凝血酶(1 000 U/瓶，上海源葉生物科技有限公司)；纖維蛋白原(牛血纖維蛋白原，美國Biosharp公司)；鹽酸(廣州化學試劑二廠)；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉(廣州化學試劑二廠)；其他試劑均為分析純。

恒溫水浴振蕩器(沈陽萊克斯儀器制造有限公司)；恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；AE觸摸式彩屏電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；3H2ORI智能高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；P4型雙光束紫外可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限責任公司)；Waters 1525高效液相色譜儀(重慶偉琪儀器有限公司)；pH計；MIcroposep Advance離心濃縮管；10 mL和100 mL移液槍等。

2 實驗方法和結果

2.1 酪蛋白酶解液的制備 吳雄等[10]用星點設計-效應面法酶解酪蛋白，得到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶四酶復合酶解酪蛋白的工藝條件。本研究選取表1中4種最佳方案分別對酪蛋白進行復合酶解和混合酶解。稱量4.0 g酪蛋白,料水比為1∶7(m/V)，反應體系pH為7.0；根據文獻4種蛋白酶混合酶解溫度設置為50 ℃；按照每種酶的最適酶用量，加入適量菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶[10]，在50 ℃水解3 h；水解結束，滅活后冷卻至室溫，以5 000 r·min-1離心10 min。剩下的3個組合的混合酶解以同樣的方法進行試驗。

復合酶解步驟為：取一份酪蛋白溶液，加入一定量的菠蘿蛋白酶，在pH為7.0、60 ℃條件下水解3 h，取出滅活后冷卻至常溫；然后加入適量胰蛋白酶，50 ℃水解3 h，滅活后冷卻至常溫；再加入適量中性蛋白酶，50 ℃水解3 h，滅活后冷卻至常溫；放入離心機中以5 000 r·min-1離心10 min[10]。其余組合同以上步驟。

2.2 抗凝血活性的測定 酶水解物的活力用 ATU 表示，測定方法為凝血酶滴定改進法[11]。測得4個組合混合酶解和復合酶解的抗凝血活性如表1。

表1 混合酶解和復合酶解抗凝血活性

從數據可知“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”組合復合酶解抗凝血活性最高，為100.0 ATU·mL-1，“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶”混合酶解抗凝血活性較低，為90.0 ATU·mL-1。選擇抗凝血活性最高的四酶“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”復合酶解液作為樣品Ⅰ進行分離純化。

2.3 超濾法分離抗凝血肽 樣品Ⅰ采用截留分子量為1 kD、3 kD的超濾離心管設置轉速為3 000 r·min-1，離心30 min，離心結束輕輕取出溶液，獲得4個組分：截留分子量1 kD濃縮液(以下簡稱1 kD濃縮液)、截留分子量3 kD濃縮液(以下簡稱3 kD濃縮液)；截留分子量為3 kD濾過液和1 kD濾過液 (濾過液指透過超濾膜留在外管的溶液，濃縮液指留在超濾膜以內的溶液)。測定其抗凝血活性，具體數據如表2。

表2 超濾酶解液的抗凝血活性

樣品Ⅰ經過超濾， 1 kD濃縮液和3 kD濃縮液的抗凝血活性分別為75 ATU·mL-1和50 ATU·mL-1；3 kD和1 kD濾過液的抗凝血活性分別為30 ATU·mL-1和15 ATU·mL-1。兩種濾過液抗凝血活性較低，故不考慮繼續進行純化；選擇1 kD濃縮液和3 kD濃縮液測定其體外溶栓和抗凝血實驗；對1 kD濃縮液進行純化。

2.4 體外溶栓和抗凝血實驗

2.4.1 體外抗凝血實驗 體外抗凝血實驗參考[12]，兔耳后采血，待血液未凝固，取5支試管，編號，一號管加入兔血2.0 mL，二號管-兔血∶4%檸檬酸鈉溶液(V∶V)=1∶1，三號管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=9∶1，四號管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=6∶4，五號管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=1∶1。將五只試管放入水浴鍋中于37 ℃水浴3 min，觀察血液凝固時間。3 kD濃縮液同以上方法進行實驗。

1 kD濃縮液一號管兔血1min凝固，二號管48 h后凝固，三號管30 min后凝固;四號管48 h后沒有凝固。五號管48 h后沒有凝固。實驗表明經過截留分子量為1 kD的超濾膜的酪蛋白酶解液具有抗凝血作用。圖1(1)～(5)分別為1 kD濃縮液一號管、二號管、三號管、四號管和五號管血液凝固情況。

圖1 1 kD濃縮液抗凝血實驗結果

3 kD濃縮液一號管兔血1 min凝固，二號管48 h后凝固，三號管30 min后凝固;四號管48 h后沒有凝固。五號管48 h后沒有凝固。實驗表明3 kD濃縮液具有抗凝血作用。圖2(1)～(5)分別為3 kD濃縮液一號管、二號管、三號管、四號管和五號管血液凝固情況。

圖2 3 kD濃縮液抗凝血實驗結果

2.4.2 體外溶栓實驗 將兔血倒在培養皿中，取一段棉線浸泡在兔血中，待血液凝固后將棉線剪成3～4 cm小段，一段浸泡在樣品溶液中，一段浸泡在生理鹽水中，將兩份溶液于37 ℃下靜置24 h，觀察溶液與棉線狀態，拍照保存。結果如圖3所示。

圖3 1 kD、3 kD濃縮液體外溶栓實驗

圖3中(a)、(d)分別是血栓條開始放進生理鹽水中和24 h后中的狀態，(b)、(e)分別是血栓條放進1 kD濃縮液和24 h后的狀態，(c)、(f)血栓條放進3 kD濃縮液和 24 h后的狀態，圖3實驗結果表明，血栓條在1 kD濃縮液和3 kD濃縮液中24 h后均由紅色變成白色，由此得出1 kD、3 kD濃縮液具有體外溶栓作用。

2.5 凝膠滲透色譜(GPC)測定肽分子量分布

2.5.1 GPC研究測定分子量分布研究[13]

2.5.1.1 脫鹽 選擇1 kD的透析袋。將透析袋剪成大約15 cm的小段，取一個500 mL大燒杯，加入適量2%碳酸氫鈉和pH為8.0的1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，透析袋放入燒杯中煮沸10 min，取出后用蒸餾水清洗透析袋。

將適量1 kD超濾濃縮液裝入透析袋中，取500 mL大燒杯加入蒸餾水，將樣品溶液置于冰箱中透析，每隔3 h換水，直至大燒杯中不能檢出氯離子。透析后的樣品溶液作為樣品Ⅱ。

2.5.1.2 色譜條件 色譜柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)；檢測：UV 220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃

2.5.1.3 標樣配制 稱取細胞色素C(MW12400)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)標準品用流動相溶解配制成0.2 mg·mL-1左右的標準分子量溶液。

2.5.1.4 樣品制備 稱取樣品Ⅱ100 mg于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，使用0.45 μm微孔過濾膜過濾后供進樣。

2.5.2 數據處理 樣品Ⅱ溶液在上述色譜條件下分析，用GPC軟件處理數據，得到樣品Ⅱ中肽的相對分子質量分布和其分布范圍，結果見表3。

表3 樣品Ⅱ中肽相對分子量分布情況

樣品Ⅱ的分子量分布如表3所示，綜合圖4和表3中的結果，可得出分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范圍，分子量小于1 000的占76.09%，樣品總重均分子量為1 398。

圖4 樣品Ⅱ分子量譜圖

3 結論

本實驗選用“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”組合復合酶解液進行超濾，截留分子量1 kD濃縮液抗凝血活性最高，為75 ATU·mL-1；截留分子量為3 kD濃縮液抗凝血活性為50 ATU·mL-1。選用3 kD濃縮液、1 kD濃縮液進行體外溶栓和抗凝血實驗，實驗表明3 kD濃縮液、1 kD濃縮液具有較好的體外溶栓和抗凝血作用。對脫鹽的1 kD超濾濃縮液進行分子量分布測定，實驗結果表明分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范圍，分子量小于1 000的占76.09%。后續有關1 kD超濾濃縮液的進一步分離及一級結構研究正在進行中。