端粒酶分析方法的研究進展*

董雪梅，賀　銳，章國平，蒲巍林 綜述,杜曉鐘 審校

(甘肅省婦幼保健院， 蘭州 730050)

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·綜述·

端粒酶分析方法的研究進展*

董雪梅，賀銳，章國平，蒲巍林 綜述,杜曉鐘△審校

(甘肅省婦幼保健院， 蘭州 730050)

端粒；端粒酶；端粒酶活性；測定方法

端粒和端粒酶是近年來生命科學研究的熱點之一,其在腫瘤臨床檢測與治療中已得到廣泛研究，但在生殖領域尚屬起步階段。人端粒酶活性(TA)是精子發生高度敏感性和特異性的標志物，生殖細胞中端粒酶的檢測特別是對原發性無精子癥患者睪丸灶性精子發生的診斷具有重要的臨床意義[1]。

1　TA檢測的研究進展

TA的早期檢測是Morin[2]建立的端粒重復序列延伸法，即利用端粒酶自身反轉錄合成端粒末端片斷的特性進行端粒合成,然后通過加入Rnase破壞端粒模板，采用12%聚丙烯酰胺電泳分離，放射顯影可見陽性條帶。該方法穩定性較好，但所需標本量大，敏感性差，實驗復雜,所需時間長。

Kim等[3]建立端粒重復擴增法(TRAP)，該法將端粒酶的反應產物應用聚合酶鏈反應(PCR)大量擴增，使測定的敏感性提高了約10 000倍，是近年來被全世界普遍采用的方法，但該法需將擴增產物在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進行放射顯影，因使用放射性同位素標記，易有放射性污染且價格昂貴，方法十分繁雜，臨床推廣應用受到一定限制。

1996年德國Boehringer公司用標記地高辛探針檢測端粒酶擴增產物，推出端粒酶-ELISA檢測試劑盒，該法極大簡化了PCR產物檢測操作步驟，4 h內即可得到檢測結果，但試劑盒不同批號間常出現較大差異，且試劑價格極為昂貴，臨床無法常規應用。雖現已有公司提供地高辛標記的引物，但該試劑是否穩定，尚待進一步探討。

2　TA的改進檢測技術

目前研究TA定量檢測方法是為了減少繁鎖費時的PCR檢測步驟，改進循環條件，提高敏感性和線性。端粒酶表達常見方法有電泳法和酶免法。

2.1改良端粒重復序列擴增(TRAP)-銀染法利用端粒酶在體外的RNA模板區為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6 個堿基的重復序列特性，采用PCR 方法擴增此重復序列，并進而用聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示6 個堿基差異的梯帶。根據Kim等[3]的端粒重復片段擴增方法，首先合成1個18 nt 的TS 做上游引物，端粒酶結合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每經過1次轉位合成1個GGTTAG的6核堿基重復序列，端粒酶滅活后，加入CX 做下游引物，經過多次變性-退火-延伸，擴增端粒酶延伸產物。陽性結果在凝膠電泳上顯示相隔6 bp 的梯狀條帶，條帶的多、寡、深或淺表示TA大小。采用銀染方法用于TRAP-PCR標記染色，既解決了同位素的放射性污染問題，又簡便、安全、省時，敏感性較溴化乙錠染色高5～10倍[4]。另外，硝酸銀染色僅在可見光下即可觀察，實驗結果還可經凝膠干燥后長期保存。因此，該方法有望成為生殖細胞TA檢測及惡性實體瘤早期診斷、高危患者篩選及微轉移癌灶的追蹤等新的分子生物學方法。

2.2聚合酶鏈反應-酶免法(PCR-ELISA)檢測原理為端粒酶自帶模板將端粒重復片段(TTAGGG)加到生物素標記、人工合成的P1-TS-引物的3′端，經PCR反復擴增P1-TS和P2引物間的特異產物，產生含有端粒酶特異的6核苷酸重復序列的PCR產物。將PCR產物變性后，與地高辛標記，并對端粒重復片段特異的探針雜交，雜交產物通過生物素標記的引物固定在抗菌藥物蛋白包被的微孔板上。然后采用與過氧化物酶結合的抗地高辛抗體(Anti-DIG-POD)檢測經固定的PCR產物。最后加入過氧化物酶的反應底物TMB，便可產生一著色反應產物，測定450 nm和690 nm的吸光度(A)值。根據公式A=A450-A690。

端粒酶PCR-ELISA方法簡單、方便、敏感，PCR擴增以后，通過特異性探針與PCR變性產物雜交而檢測，特異性強，可以避免PCR反應后的假陽性和假陰性，且易于定量，是檢測TA較理想的方法，將有更廣泛的臨床應用前景。

2.3熒光素-抗熒光素系統檢測法由于熒光素標記引物較為簡便、穩定，用熒光素-抗熒光素系統代替地高辛-抗地高辛耦聯法，效果良好。該法有較好的敏感性與重復性，較銀染法更為簡便快速，無同位素污染，檢測成本低，有較好的推廣應用價值。

2.4端粒酶相關功能蛋白的檢測目前研究發現TA至少受端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關蛋白(TP1/TLP1)及端粒酶催化亞單位(hTERT)的影響。hTR 是合成端粒DNA的模板，提供模板合成端粒重復序列。端粒酶在其3′端生成451個核苷酸的轉錄產物。反轉錄是在5′末端46～53個核苷酸處發生，該反應靠近端粒DNA序列。分析hTR的2級結構，可預測TA。目前用以預測hTR的2級結構的方法是研究hTR的4個構成組件，包括 CR2/CR3結構域,aCR4/CR5 結構域, H/ACA (CR6/CR8)盒,CR7 結構域[5]。TP1/TLP1的功能尚未闡明，可能不僅是結構蛋白，還是一種調節端粒酶與其他分子相互作用的調節亞單位。hTERT是TA調節的主要部分，對TA表達及維持端粒長度起決定性作用。有學者使用TaqMan熒光檢測系統建立了實時定量RT-PCR檢測hTERT相關基因表達。

2.5TA相關調節因子檢測TA在人體細胞受到嚴格的調控，這個調控過程涉及一些蛋白激酶，如hTERT基因在體外磷酸化的蛋白激酶AKT，被確定為TA負調節的蛋白激酶c-ABL。蛋白激酶C家族的成員是端粒酶反轉錄酶在體外磷酸化，導致TA，刺激hTERT啟動子活性的關鍵酶。激酶SRC作為TA的負調節，負責hTERT在氧化應激反應過程中的磷酸化反應。其他幾個激酶(如ERK1/2和JNK)也被認為負責TA調控，但其作用機制尚不清楚[6-9]。

3　結　　語

近年來，有關端粒酶的研究異常活躍，絕大多數生物細胞DNA的端粒隨著細胞分裂而縮短，當縮短到一定長度，即達到危機點時，細胞不再分裂而衰老、死亡,少數細胞逃逸危機點，激活端粒酶，從而永生或惡變[10]。正常機體細胞中TA不表達，而在干細胞、生殖細胞和90%的惡性腫瘤細胞中卻特異性地表達[11-13]。隨著對端粒酶結構、功能及調控的深入研究，其在細胞永生化及癌變中的作用也有了新的認識，生殖細胞中可檢測到TA，端粒酶在人類生殖發育中發揮著重要作用，可通過端粒酶的研究來探索影響人類生殖能力的相關因素及機制，以期對人類生殖功能、胚胎質量進行監控。有研究表明，端粒酶RNA基因在男性不育癥患者睪丸組織中的表達與生殖細胞的分布定位一致，在精細胞不發育患者睪丸組織中無端粒酶RNA基因的表達，提示TA的缺乏可能是生殖細胞發育停滯的原因之一[14]。

目前，端粒酶分析方法尚缺乏標準化，隨著端粒酶檢測技術的進一步發展，可制訂TA定性及定量的標準化檢測方法，從而研究端粒酶的表達在相關疾病監測、療效和預后判斷中的作用。深入研究端粒酶在男性生殖生理及病理學意義，探討激素及其他藥物治療的端粒酶機制，使端粒酶技術成為診斷及治療男性生殖疾病的重要手段之一。

[1]杜曉鐘，陜文生，鄭雷．少弱精子癥患者精漿中精子及睪丸組織端粒酶活性實驗研究[J]．國際檢驗醫學雜志，2011，32(12)：1277-1278．

[2]Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats[J].Cell,1989,59(3):521-529.

[3]Kim N,Piatyszek M,Prowse K,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193):2011-2015.

[4]Spagnolo DV,Turbett GR,Dix B,et al.Polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis(PCR-SSCP):a novel means of detecting DNA mutation[J].Adv Anat Pathol,1994,1(2):61-65.

[5] Devereux TR,Horikawa I,Anna CH,et al.DNA methylation analysis of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase(hTERT) gene[J].Cancer Res,1991,59(20):6087-6090.

[6]Breitschopf K,Zeiher AM,Dimmeler S.Pro-atherogenic factors induce telomerase inactivation in endothelial cells through an Akt-dependent mechanism[J].FEBS Lett,2001,493(1):21-25.

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[8]Haendeler J,Hoffmann J,Brandes RP,et al.Hydrogen peroxide triggers nuclear export of telomerase reverse transcriptase via Src kinase family-dependent phosphorylation of tyrosine 707[J].Mol Cell Biol,2003,23(13):4598-4610.

[9]Bermudez Y,Yang H,Cheng JQ,et al.Pyk2/ERK 1/2 mediate Spl- and c-Myc-dependent induction of telomerase activity by epidermal growth factor[J].Growth Factors,2008,26(1):1-11.

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[12]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer[J].Eur J Cancer,1997,33(5):787-791.

[13]Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.Telomerase activity in human breast tumors[J].Natl Cancer Inst,1996,88(2):116-122.

[14]葉哲偉，陳曉春，范民，等．男性不育癥患者睪丸組織中端粒酶RNA表達狀況的研究[J]．華中科技大學學報(醫學版)，2003，32(1)：58-61．

甘肅省自然科學基金資助項目(ZS031-A25-065-E)。

，E-mail:dxzh5678@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.032

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1673-4130(2016)19-2738-03

2016-02-18

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