同型半胱氨酸檢測技術的研究進展

陳尚武 綜述，李青華 審校

(廣西壯族自治區梧州市藤縣人民醫院檢驗科　543300)

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同型半胱氨酸檢測技術的研究進展

陳尚武 綜述，李青華 審校

(廣西壯族自治區梧州市藤縣人民醫院檢驗科543300)

同型半胱氨酸；色譜技術；酶法分析技術；熒光偏振免疫分析法；熒光探針檢測技術

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸去甲基后形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環的中間產物[1]。血漿Hcy是一個總稱，包括還原型Hcy，雙硫Hcy，混合雙硫半胱氨酸-Hcy和混合雙硫蛋白質-Hcy，正常情況下游離Hcy較少，主要以蛋白質形式存在[2]。

Mccully[3]描述Hcy尿毒癥患者的血管病變特征，患者的代謝障礙在任何階段，Hcy是引起臨床表現的原因，由此提出Hcy可能與動脈粥樣硬化有關。Lcken首次報道冠心病患者存在Hcy代謝障礙。Kang等發現MTHFR與Hcy代謝有關。相關臨床資料顯示Hcy是冠心病的一個新的獨立危險因素，可作為心腦血管病、腎臟病、老年癡呆與帕金森癥、妊娠合并癥、先兆子癇與不良事件的預測指標，是近年來醫學研究的新熱點。Hcy的檢測方法也不斷更新，現就Hcy的檢測技術綜述如下。

1　Hcy概述

Hcy于1932年由Vincent Du Vigheaud發現，分子式為C4H9NO5S，來源于蛋氨酸，由甲硫氨酸轉甲基后生成。合成途徑為蛋氨酸在ATP參與下，由蛋氨酸腺苷轉移酶(MAT)催化，生成S-腺苷蛋氨酸(SAM)，SAM又經Hcy甲基轉移酶(HMTase)催化，去甲基生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，接著由SAH水解酶催化生成Hcy。

Hcy在體內的代謝：(1)Hcy在胱硫醚縮合酶(CBS)的催化下與絲氨酸縮合成胱硫醚，胱硫醚又由胱硫醚酶催化生成半胱氨酸和α酮丁酸，代謝產物進入三羧酸循環或由尿液排出，2步轉化均需維生素B6參與或經氧化結合生成高胱氨酸。(2)Hcy可在葉酸和維生素B12的輔助下甲基化重新合成甲硫氨酸，此過程需要甲硫氨酸合成酶(MS)催化，且須有N5-甲基四氫葉酸(THF)作為甲基供體。(3)釋放到細胞外液。凡是涉及Hcy代謝的各種酶和輔助因子異常均可導致血液中總同型半胱氨酸的增加而形成高同型半胱氨酸血癥。高同型半胱氨酸與老年性癡呆、腎病、糖尿病、妊娠相關病(如子癇、先天缺陷、死胎、流產)等相關。因此，檢測Hcy具有重要的臨床意義。

2　Hcy檢測技術

2.1色譜技術1901年俄國植物學家Tswett在進行植物色素的分離試驗發明，“色譜法”一詞最早正式出現在《葉綠素的物理化學研究》和《吸附分析與色譜法》這2篇論文中[4]。色譜法根據分離原理的不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜；根據固定相的不同可分為柱色譜、薄層色譜、紙色譜；根據流動相物態的不同分為氣相色譜和液相色譜。應用色譜法檢測Hcy主要有紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，由于質譜(MS)技術的不斷成熟，Hcy由單一的色譜法發展到色譜與質譜的連用檢測。

2.1.1薄層色譜法1962年Carson等[5]對患者的尿液進行化學分析，經紙色譜進一步分析確定為Hcy。國內利用薄層色譜技術檢測Hcy的報道在上世紀80～90年代較多，且大多數方法為吳有光等和閆英地等[6-10]的雙向薄層色譜法分析氨基酸，如利用微型雙向薄層色譜法檢測氨基酸代謝病，利用雙向展開劑，第1向展開劑為異丙醇-乙酸乙酯-丙酮-甲醇-仲戊醇-氨水-水(9∶3∶3∶1∶1∶3∶3)，第2向展開劑為正丁醇-丙酮-異丙醇-甲酸-水(9∶4∶4∶1.5∶3),以鎘-茚三酮酸化丙酮溶液為顯色劑，通過與標準圖譜比對，定性檢測1例Hcy尿毒癥患者，雖然薄層掃描法可用于Hcy的定量檢測，但因該方法靈敏性低、重復性差、標本前處理操作繁瑣等原因，臨床未能得到普及[11]。

2.1.2氣相色譜法1987年Stabler等[12]首先報道GC-MS用于血漿Hcy檢測，該法首先在標本中加入內標物，沉淀蛋白后上清液用離子交換柱色譜進行預處理，使用水復溶,衍生處理后進樣經GC-MS分析,以保留時間和質譜進行定性和定量。Myung等[13]應用固相微萃取技術處理標本，采用GC-MS同時檢測樣品中的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸含量。有研究報道，將GC法聯合電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)檢測血清總的Hcy、半胱氨酸和蛋氨酸，該法往樣品中加入硼氫化鈉打開二硫鍵，最終衍生成N-三氟乙酰-O-異丙酯衍生物進行測定[14]。雖然這些方法具有高度的精密性、靈敏性和專一性，但操作復雜,化學試劑毒性大，耗時長，難以適合常規臨床化學實驗室的使用，無法普及。

2.1.3液相色譜法根據檢測方法的不同又可分為紫外法(HPLC-UV)、熒光法(HPLC-FD)、示差折光法(HPLC-RID)、電化學法(HPLC-ED)等。HPLC-FD方法主要采用柱前或柱后衍生技術，然后通過HPLC將衍生物分離，并由熒光檢測器進行檢測。相關研究報道使用了這種方法[15-17]。HPLC-ED具有標本處理簡單,無需衍生化等特點,又具較高的靈敏性、專一性、穩定性,應用比較廣泛，文獻報道也比較多[18-19]。

近幾年研究表明較多的是HPLC-MS聯用方法，Espina等[20]建立高效液相色譜聯合電感耦合等離子體質譜和電噴霧電離串聯質譜(HPLC-ICP-MS-ESI-MS)法測定血清中游離Hcy；國內還采用超高效液相色譜-質譜法(UPLC-MS/MS)聯合檢測血清中葉酸代謝物[21]，該法采用 BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，以甲酸-乙腈為流動相，流速為 0.4 mL/min， 進樣體積 5 μL，梯度洗脫，電噴霧正離子模式下以多反應檢測(MRM) 方式，6 種葉酸代謝產物[葉酸、5-甲基四氫葉酸(5-MeTHF) 、5-甲酰四氫葉酸( 5-FoTHF)、Hcy、SAM、SAH] 分別在一定范圍內呈線性相關，加樣回收率及日內與日間精密度良好。

HPLC法是目前公認的高精密度的濃度檢測方法，具有特異性高、靈敏度高、重復性好的優點，色譜條件確定后一般均可獲得穩定的結果。

2.2酶法分析技術酶法分析技術是以酶為試劑測定酶促反應的底物、輔酶、輔基、激活劑、抑制劑及酶偶聯法測定酶活性等的方法。由于酶作用的特異性高，成分復雜的血清等液體標本不需進行預處理就能檢測，極大簡化了實驗操作程序，試劑酶的本質大多是蛋白質，酶促反應的條件溫和，無毒性，具有良好的應用前景。

2.2.1酶循環法羅氏公司采用酶比色法測定血清Hcy，其原理為氧化型 Hcy首先被還原為游離 Hcy，然后在 Hcy S-甲基轉移酶催化下，再與S-腺苷甲硫氨酸反應形成甲硫氨酸(Met)和SAH。SAH的評估是通過一種偶聯的酶反應，其中 SAH經 SAH 水解酶催化形成腺苷(Ado)和 Hcy ，而 Hcy 又循環進入 Hcy轉化反應中，形成的循環反應擴大了檢測信號從而被檢測。

2.2.2酶轉換法原理為氧化型Hcy首先被還原劑還原為還原型Hcy，還原型Hcy隨后被分解，分解產物在氧化劑(如FeCl3)存在下與呈色劑二乙基對苯二胺硫酸鹽反應形成甲基藍色化物，甲基藍色化物與標本Hcy的濃度呈正比，通過測定吸光度的變化值，即可檢測標本的Hcy總濃度。

眾多報道顯示酶法分析技術與熒光偏振免疫法(FPIA)及高效液相色譜法(HPLC)進行對比，各項指標均無明顯差異，酶法檢測血清Hcy具有操作簡單、精密度良好，線性范圍寬等諸多優點，且結果準確，值得推廣[22-24]。

2.3FPIA法是一種定量免疫分析技術，其基本原理是熒光物質經單一平面的藍偏振光(485 nm)照射后，吸收光能躍入激發態，隨后回復至基態，并發出單一平面的偏振熒光(525 nm)。偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關，與其(受激發時)轉動的速度呈反相關。FPIA最適宜檢測小至中等分子物質，常用于藥物、激素的檢測。采用競爭反應原理，在缺乏未標記分析物(通常是待測樣品)時熒光信號最強；加入未標記分析物后，在已標記和未標記標本之間的競爭將減弱熒光信號。熒光信號強度與游離的分析物濃度呈正比，與待測標本中未標記分析物的濃度呈反比。

FPIA法的優點是靈敏度高，如檢測Digoxin的靈敏度可達0.2 ng/mL，精密度高、速度快、操作簡便，標本用量少，儀器不需每日校準。缺點是試劑盒專屬性強，儀器設備昂貴。

2.4熒光探針檢測技術熒光探針一般由熒光基團和識別基團通過連接基團連接而成。熒光基團具有大π鍵共軛體系,屬剛性平面結構,是發射熒光并通過儀器輸出電信號的信號基團。識別基團是通過絡合或(和)化學反應與被分析物發生作用的部分。當識別基團選擇性地與被分析物結合或反應時,引起探針的化學環境發生改變,一般表現為熒光基團突光信號的增強或減弱。

Hcy、半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(GSH)等是生物體中主要的小分子生物硫醇化合物,在維持生物的正常生理活動中起重要作用。根據探針與生物硫醇化合物的反應機制,可把探針分為2大類[25]。第1類主要是利用生物硫醇分子中巰基的親核性、還原性和金屬離子絡合能力與探針分子發生反應。第2類熒光探針設計主要是利用熒光探針與生物醇中巰基和氨基官能團發生協同反應。

探針檢測技術目前臨床應用的報道非常少，但研究性文獻較多。Yang等[26]研究報道利用醛基探針檢測小分子生物硫醇化合物，該探針可選擇性地與硫醇化合物中的Hcy和半胱氨酸發生反應，且成功應用到生物成像中檢測低毒性的活細胞內半胱氨酸和Hcy。不同物質設計的熒光基團，與探針的反應機制與也不相同，如以黃酮類、香豆素類、吡唑啉類物質等。Xie等[27]研發設計的熒光探針基于醛基的環合反應，通過抑制C=N鍵誘導分子內氫鍵作用引起熒光淬滅而使吸收峰出現藍移(107 nm)，該機制已通過H1NMR譜和MS譜的分析驗證。Zhang等[28]基于黃酮類物質設計的熒光探針對半胱氨酸和Hcy的靈敏度高。Dai等[29]采用醛基香豆素氯化物研發熒光探針，GSH、Hcy、半胱氨酸的檢測限分別是0.08、0.09、0.18 μmol/L。

熒光探針技術具有體積小、合成簡單、靈敏度高、選擇性好、可直接觀察等優點。缺點：(1)一些熒光探針溶解在考察體系后，難以提取分離，不具備多次重復使用。(2)因一些小分子熒光探針的非水溶性與不良反應，使其臨床應用受到限制。(3)小分子熒光探針難以制作成光學器械與光學儀器結合，無法實現自動化檢測。由于熒光探針的普適性不強，因此應用受到較大限制。

3　小　　結

綜上所述，血漿或血清Hcy檢測可給臨床診斷或觀察提供必要的科學依據，檢測方法較多且各具特點，目前臨床主要以酶法分析技術為主，標本不需進行預處理，極大地簡化實驗操作程序，適應臨床醫學實驗室的要求，值得臨床推廣應用。

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