丙肝病毒感染對C反應蛋白表達的影響

袁麗，劉芳，鄔開朗，李一榮

(1.武漢大學中南醫院檢驗科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學生命科學學院，湖北 武漢 430072)

丙肝病毒感染對C反應蛋白表達的影響

袁麗1，劉芳2，鄔開朗2，李一榮1

(1.武漢大學中南醫院檢驗科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學生命科學學院，湖北 武漢 430072)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)在體內外對C反應蛋白(CRP)表達的影響。方法收集武漢大學中南醫院2015年1月至2016年2月HCV感染患者標本106例和健康體檢者標本110例，免疫透射比濁法檢測其血清CRP水平，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HCV感染的Huh7.5.1細胞及其對照細胞中CRP mRNA的表達。結果HCV感染患者血清CRP水平為(8.62±5.56)mg/L，顯著高于健康體檢者的(1.35±0.71)mg/L，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；HCV感染的Huh7.5.1細胞中CRP mRNA的表達水平較對照細胞高，其CRP/β-actin灰度比值分別為0.31和1.5。結論HCV感染能夠上調肝細胞CRP的表達。

丙型肝炎病毒；C反應蛋白；逆轉錄聚合酶鏈反應；表達

丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起人類丙型肝炎的病原體，全球約1.7億人感染HCV，50%～80%的患者會轉變成為慢性感染患者，其中10%～20%的慢性感染者發展為肝硬化，每年1%～4%的肝硬化患者最終發展成為原發性肝癌(HCC)[1]。C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種急性時相反應蛋白，在臨床感染性疾病、心血管疾病診斷、監測等方面得到廣泛應用[2]。HCV感染能夠引起機體的炎癥反應，但目前為止，HCV對CRP表達的影響還不清楚。本研究主要通過體內外實驗探討HCV對CRP表達的調節作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集收集武漢大學中南醫院2015年1月至2016年2月期間HCV感染的患者106例(HCV患者組)，其中男性62例，女性41例，平均年齡(53.2±21.5)歲。所有HCV患者抗-HCV及HCV RNA均為陽性，其診斷標準符合中華醫學會制定的《丙型肝炎防治指南》。健康對照組為110例健康體檢者，其中男性57例，女性53例，平均年齡(46.3±17.2)歲，所有患者均排除心、腦、腎等重要器官疾病及呼吸道病毒和其他嗜肝病毒感染。受檢者均采集清晨空腹靜脈血3 mL，分離后的血清于-20℃冰箱保存待測。

1.2 材料 人肝癌細胞系Huh7.5.1及HCV病毒JFH-1株感染的Huh7.5.1細胞購自中國典型培養物保藏中心(CTCC)；RNA提取試劑TRIzol R和M-MLV逆轉錄酶均購自Invitrogen公司；血清CRP的檢測購自寧波普瑞柏生物技術有限公司；PCR擴增儀購自北京東勝創新。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 Huh7.5.1細胞在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，37℃，5%的CO2細胞培養箱中進行培養。

1.3.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 從TRIzolR試劑提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對照細胞的總RNA，M-MLV逆轉錄酶反轉錄成cDNA，用CRP基因的檢測引物5′-TCCCAA GGATTGAGTTATG-3′(上游引物)，5′-GTGGTCAAG GCTCTGTTG-3′(下游引物)進行PCR擴增，同時設立β-肌動蛋白(β-actin)作為對照[3]，PCR反應體系為25 μL，反應條件為95℃預變性5 min，然后按94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環25次，最后72℃延伸10 min，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 血清CRP檢測 血清標本及細胞上清中CRP檢測采用免疫透射比濁法。使用全自動生化分析儀ADVIA2400進行檢測。實驗重復3次。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組受檢者的CRP血清水平比較 CRP在健康對照組為(1.35±0.71)mg/L，在HCV組為(8.62± 5.56)mg/L，兩組比較差異有顯著統計學意義(t=5.654，P＜0.01)。

2.2 HCV在細胞水平上調CRP的表達 與對照細胞比較，感染了HCV的Huh7.5.1細胞CRP mRNA表達水平升高，CRP/β-actin灰度比值分別為0.31和1.52。同時，感染了HCV的Huh7.5.1細胞上清中CRP含量為(11.64±0.85)mg/L，明顯高于對照細胞的(2.59±0.38)mg/L，差異有統計學意義(t=5.742，P＜0.05)，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測CRP mRNA的表達

3 討 論

CRP是環狀五球體蛋白，屬于Oligomeric鈣結合蛋白，相對分子質量約120 kD。表達人類CRP的基因位于染色體1q21-1q23，由5個相同的單體以非共價鍵構成，CRP主要由肝臟合成，在炎癥、腫瘤以及急性冠狀動脈綜合征患者中顯著升高[2]。

乙肝病毒(HBV)和HCV感染機體后均引起肝臟的炎癥反應，研究表明，乙肝病毒能夠上調CRP的表達[4]。為探討HCV對CRP的調節作用，在本研究中，我們檢測了HCV患者及健康對照組CRP的血清學水平，發現HCV患者血清CRP水平顯著高于健康對照組，證實了丙肝病毒在體內對CRP具有上調作用。進一步采用RT-PCR檢測了HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞和及其對照細胞中CRP的表達差異，結果顯示，HCV病毒感染的Huh7.5.1中CRP的mRNA含量明顯高于對照細胞，且HCV感染的Huh7.5.1細胞上清中CRP的表達水平顯著高于對照細胞，表明HCV能夠在體內上調CRP的表達。

HCV本身不具有肝細胞毒性，宿主的免疫因素對HCV感染的不同結局起到決定性的作用。HCV可觸發機體的固有免疫和適應性免疫系統，造成免疫介導的肝損傷，臨床表現為慢性肝炎、肝硬化和肝癌等。細胞因子將固有免疫和適應性免疫連接起來，在免疫應答的啟動與調節中扮演重要角色。研究表明，多種白細胞介素與HCV的感染和致病密切相關，包括白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-23和IL-27等[5-7]。其中，IL-6是一種重要的炎癥細胞因子，也是CRP基因表達的主要調控因子，可在轉錄水平上誘導肝細胞合成CRP，且這一作用可被IL-1β加強[8]。研究表明，HBV通過HBV x蛋白的反式激活作用上調IL-1β和IL-6基因的表達[9]，進而促進CRP的合成和分泌。因此，我們推測，HCV也可能是通過上調IL-1β或IL-6而間接上調CRP基因的表達。

總之，本研究通過體內外實驗證實了HCV能夠上調CRP的表達，但HCV調節CRP表達的具體分子機制尚待進一步研究。

[1]Walker CM,Grakoui A.Hepatitis C virus:why do we need a vaccine to prevent a curable persistent infection?[J].Curr Opin Immunol. 2015,35:137-43.

[2]Skogmar S,Sch?n T,Balcha TT,et al.Plasma levels of neopterin and C-reactive protein(CRP)in tuberculosis(TB)with and without HIV coinfection in relation to CD4 cell count[J].PLoS One,2015,10 (12):e0144292.

[3]祝成亮,李艷,劉興暉,等.丙型肝炎病毒對白細胞介素32表達影響的研究[J].海南醫學,2014,9(25):2708-2709.

[4]高國生,朱海超,胡愛榮,等.乙型肝炎病毒對超敏C反應蛋白表達的影響及其臨床意義[J].中華微生物學和免疫學雜志,2011,31 (10):931-933.

[5]Omran MH1,Ibrahim NE,Youssef SS,et al.Relation of interleukin-1 β gene to treatment response in chronic patients infected with HCV genotype 4[J].J Infect Dev Ctries,2013,7(11):851-858.

[6]Torbati E,Ghassab RK,Davachi ND.Recombinant HCV core protein and the secretion of associated cytokines(IL-6,TNF-α and IFN-γ)in immunized mice[J].Pak J Biol Sci,2013,16(24): 2042041-5.

[7]Ashrafi Hafez A,Ahmadi Vasmehjani A,Baharlou R,et al.Analytical assessment of interleukin-23 and-27 cytokines in healthy people and patients with hepatitis C virus infection(genotypes 1 and 3a)[J]. Hepat Mon,2014,14(9):e21000.

[8]Bacci MR,Leme RC,Zing NP,et al.IL-6 and TNF-α serum levels are associated with early death in community-acquired pneumonia patients[J].Braz J Med Biol Res,2015,48(5):427-432.

[9]Xiang WQ,Feng WF,Ke W,et al.Hepatitis B virus X protein stimulates IL-6 expression in hepatocytes via a MyD88-dependent pathway[J].J Hepatol,2011,54(1):26-33.

Effect of hepatitis C virus infection on the expression of C-reactive protein.

YUAN Li1,LIU Fang2,WU Kai-lang2, LI Yi-rong1.1.Department of Clinical Laboratory,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA; 2.College of Life Sciences of Wuhan University,Wuhan 430072,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of C-reactive protein(CRP)in vitro and in vivo.MethodsAtotal of 106 samples of HCV infected patients and 110 samples of healthy individuals in Zhongnan Hospital of Wuhan University from January 2015 to February 2016 were collected.Serum CRP levels were measured by immune transmission turbidity method.The expression of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cells was measured by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsSerum CRP levels were(8.62±5.56)mg/L in patients with HCV infection,which were significantly higher than those in healthy individuals(1.35±0.71)mg/L,with statistically significant difference(P＜0.01).The expression level of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV was significantly higher compared with that in control cells,and the gray ratio of CRP/beta-actin was 0.31 and 1.5 respectively.ConclusionHCV infection can upregulate the expression of CRP in liver cells.

Hepatitis C virus;C-reactive protein;Reverse transcription polymerase chain reaction;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2016）18—2932—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.003

2016-04-15)

國家自然科學基金（編號：31270206）

李一榮。E-mail：liyirong838@163.com