外周血游離DNA作為腫瘤標志物的臨床展望和生物學意義*

瞿國英 綜述，郁愛平 審校

(上海濰坊社區衛生服務中心檢驗科，上海 200122)

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·綜述·

外周血游離DNA作為腫瘤標志物的臨床展望和生物學意義*

瞿國英 綜述，郁愛平△審校

(上海濰坊社區衛生服務中心檢驗科，上海 200122)

關鍵詞:CFDNA;腫瘤標志物;基因改變

早在1977年，即有科學家發現在癌癥患者血漿和血清中循環游離DNA(CFDNA)異常增高[1]。然而直到近期，人們才意識到癌癥患者外周血CFDNA可以作為癌癥早期診斷和預后的標志物，并加以研究。至今，已發現在多種類型腫瘤患者中，包括結直腸癌、胰腺癌、肺癌等，CFDNA出現特征性基因改變，包括點突變、微衛星不穩定、DNA超甲基化、雜合子缺失等[2-5]。多項研究表明，CFDNA的變化與腫瘤原發部位基因改變完全相同。雖然，CFDNA的基因改變與數量上升不能鑒別特定腫瘤，但是處于腫瘤晚期且發生轉移的患者往往伴有CFDNA的顯著升高。因此，利用CFDNA傳遞的遺傳信息，對腫瘤患者進行早期分子診斷和預后評估，具有潛在臨床價值。

1CFDNA的特征與起源

CFDNA在健康人外周血濃度平均值為30 ng/mL。推定每個細胞DNA水平為6.6 pg，則1 mL血中平均含有5 000個DNA基因組。在系統紅斑狼瘡、關節炎、肝炎、癌癥患者外周血中，CFDNA常表現為高水平。癌癥患者外周血CFDNA平均值為180 ng/mL[4-6]。CFDNA為雙鏈，常與蛋白結合成為核蛋白復合物，但是目前復合物的具體成分還不清楚[7]。對CFDNA實行低百分率瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示0.18～21.00 kbp的DNA片段在標本間差異最大。CFDNA在血液中清除速率極快，它對DNAse.1等血漿核酸酶極為敏感。但是肝臟和腎對CFDNA的生理清除作用還未徹底闡明。胎兒分娩后，對母體中胎兒CFDNA的清除研究表明，CFDNA的半衰期為16.3 min[8]。如果腫瘤患者CFDNA的半衰期類似母體中胎兒CFDNA的清除率，那么每小時必須有數百萬個DNA基因組釋放入血才能維持血中CFDNA濃度達到180 ng/mL。這個數目看似巨大，但與同時機體內新陳代謝更新的細胞相比，只占很小一部分。

CFDNA的腫瘤起源說的產生是因為在腫瘤患者的腫瘤位點和CFDNA發現了原癌基因和抑癌基因發生相同突變。與此結果相符的是，腫瘤患者CFDNA的生物物理特性與腫瘤細胞極為相似。腫瘤患者的CFDNA經體外致癌物處理后，相比正常DNA雙鏈穩定性下降，健康志愿者的CFDNA同樣處理后卻與正常DNA一樣保持雙鏈穩定。

源自腫瘤的CFDNA占全部CFDNA比例在個體間差異極大。Jahr等[9]通過定量PCR發現外周血中腫瘤CFDNA占全體CFDNA的比例維持在10%～90%，腫瘤比例最高者總體CFDNA較低。但是，Hibi等[10]的研究卻表明腫瘤CFDNA所占比例相當低(為0.2%～10.0%)。這些差異有可能反映腫瘤狀態(組織學、腫瘤起源、分級、大小)也可能是技術問題(外周血標本處理、CFDNA分離、突變檢測)。腫瘤的位點、組織學、分級分期對于CFDNA有很大影響，然而目前還缺乏合適的數據系統比較不同類型腫瘤之間CFDNA的差異。高水平的CFDNA并不能特異反映腫瘤，因為其他炎癥病理狀況，如肝硬化、肝炎、系統性紅斑狼瘡都會出現CFDNA的升高。所以，確定腫瘤特異的遺傳改變是評估CFDNA腫瘤起源的最好辦法。

2CFDNA釋放入血的機制

游離DNA釋放入血的生物機制目前仍不明晰。目前研究人員主要提出了2種主要機制：一是凋亡和壞死；二是完整細胞釋放入血并發生裂解。

腫瘤位點發生凋亡和壞死都較為頻繁。凋亡細胞具有特征化的DNA片斷典型模式(“凋亡階梯”)。在某些情況下，CFDNA表現出凋亡細胞才有的階梯模式。但是，大片段甚至接近全基因組大小的DNA片段也常能檢測到。對DNA特定大小片段進行定量PCR發現，血漿中完整DNA的量相比正常人有升高。近期，Diehl等[11]發現，發生DNA突變的大多為小片段，而大片段大多為野生型。據此，他們提出突變DNA來自壞死細胞經巨噬細胞消化后的產物。按照這個理論，突變CFDNA的水平應該與腫瘤壞死的程度相一致。但是也有報道發現在前列腺癌、乳腺癌、肝癌患者中有完整細胞釋放入血。值得注意的是，這些細胞并非轉移細胞，它們僅僅能夠進入血液而不能侵襲其他器官，它們在血液中的降解產物構成了CFDNA的大片段。Anker等[12]提出細胞會主動分泌DNA，以核蛋白復合物的形式入血。該假說基于培養細胞基質中出現新合成的雙鏈DNA。許多附加實驗表明DNA釋放進入基質并不受到細胞周期的影響。然而，目前仍然缺乏數據闡明DNA主動分泌的機制。

目前對于CFDNA在機體內發揮何種生物學功能還不確定。有人提出釋放入血、發生基因突變的CFDNA可能會重新進入細胞發揮功能。它會整合進入細胞并改變接受細胞的遺傳信息。這種學說甚至導致了“基因組轉移”概念的提出。認為腫瘤DNA具有改變遠端器官中干細胞基因組的潛在能力。

3外周血CFDNA的檢測方法

CFDNA可由酚/氯仿或者商業化離子交換試劑盒抽提獲得。已有多種高靈敏度方法檢測血漿或血清中的CFDNA。其中包括競爭性放射免疫測定，靈敏度可達25～1 000 ng/mL，以及對經切口翻譯純化的DNA進行直接放射標記(靈敏度可達1.6 ng/mL)。DNA嵌入染料，如SYBR Green，Hoechst等，靈敏度還無法達到檢測微量DNA的水平。利用免疫測定檢測組蛋白和雙/單鏈DNA已有商業化試劑盒(Cell Death Detection plus-EILSA，Roche,Mannheim,Germany)，但是試驗結果無法與其他方法比較確定敏感性。現在，最簡單、最適宜進行CFDNA濃度測定的方法還是應用特異結合于DNA雙鏈的染料(PicoGreen,Molecular Probes,Inc,Eugene,OR)，能夠檢測到25 pg/mL的雙鏈DNA[13]。

早期，人們采用微衛星分析檢測CFDNA中等位基因變化，發現與腫瘤DNA具有較高一致性。然而，必須考慮到源自腫瘤的CFDNA只占了全部CFDNA中很小一部分，腫瘤DNA等位基因改變在野生型的大背景下難以檢測得到。通過附加PCR測定微衛星不穩定可檢測到CFDNA中0.1%～0.2%的不穩定DNA。CFDNA基因點突變的檢測，如TP53、KRAS2，相比腫瘤組織需要更加精密的方法。在很多情況下，直接基因測序的靈敏度并不能保證，因為它無法檢測到野生型基因背景下小于25%的突變信號。后來出現了2種改進方法，一種是限制性位點突變(RSM)，對DNA先進行限制性酶消化后再行PCR。另一種是限制性片段長度多態性(RFLP)，即PCR完成后再進行限制性內切酶消化。但是這兩種方法只能檢測到限制性酶切位點特異的點突變，無法大量應用[14-16]。最近，人們應用2種較高靈敏度的方法定量檢測特定位點的突變，分別是短片斷寡核苷酸質譜分析(SOMA)和乳膠顆粒擴增磁性(BEAMing)。在SOMA方法中，通過PCR和酶消化產生突變點周圍的小DNA片段，然后根據HPLC-電噴離子質譜確定特征。一項在非洲岡比亞的病例對照研究采用SOMA檢測突變CFDNA，TP53基因在249位絲氨酸突變在肝細胞癌患者中位數水平較高(2 800 copy/mL，范圍500～11 000 copy/mL)，肝硬化和健康者中位數水平均為500 copy/mL。249位絲氨酸突變對于鑒別診斷肝細胞癌具有統計學意義[17]。在BEAMing方法中，第一輪PCR的產物經標記轉移到顆粒上，然后對于突變位點進行單堿基延伸，使得野生型與突變型和不同的熒光染料結合，最后進行流失細胞術分析。該方法對晚期結直腸癌患者定量分析發現，血漿中APC突變平均值為5 300 copy/mL[18]。

對于非特定位點突變的檢測，大部分研究傾向于從采用預先篩選法。比如變性高壓液相色譜(DHPLC)、時間溫度梯度電泳(TTGE)、單鏈構相多態性(SSCP)。這些方法的靈敏度范圍為3%～50%(根據突變的位置和類型)，因此只適合在腫瘤CFDNA所占比例較大時檢測突變[19]。

4CFDNA與臨床研究

腫瘤患者體內CFDNA相比健康人有升高使得CFDNA成為腫瘤早期診斷和預后評估的有用工具。然而，目前還無法確定CFDNA應用于篩選的臨床決定濃度。而且CFDNA濃度與患者實際的臨床、生物學、組織學特征之間的聯系還未建立起來。比較有希望的是檢測基因改變的CFDNA應用于早期診斷或預后評估。突變CFDNA檢測早于傳統腫瘤診斷的例子還不多。對49例支氣管鏡檢查疑似肺癌患者的CFDNA測定中，Allan等[20]發現有13例可檢測到雜合子缺失，其中有2例，遺傳改變的CFDNA檢測早于腫瘤診斷幾個月。所以，對于一些傳統方法難以檢測的腫瘤，遺傳改變的CFDNA可能是有用工具。CFDNA的濃度變化和遺傳改變也可作為疾病治療后監測復發的有用標志。研究發現臨床癥狀的改善往往伴有CFDNA濃度下降。有多項研究表明，腫瘤治療后患者CFDNA的基因改變，如KRAS2突變、多位點微衛星不穩定、CDKN2A的超甲基化，可反映疾病的復發程度。在一項大規模的結直腸癌患者回訪研究中，Ryan等[21]發現血清中KRAS2突變對于疾病復發具有91.0%的靈敏度、88.0%的特異度、62.5%的陽性預測值。

在過去的10年中，對CFDNA的多項研究使得它成為認識腫瘤的有用工具。然而，進一步的臨床應用和群體研究還需要更深入了解DNA釋放入血的機制，CFDNA與疾病進展的聯系基本問題。目前而言，CFDNA作為腫瘤標志物的優勢在于它可以經非侵入性方法獲得，患者痛苦較少，操作性好，結構穩定，易于保存。缺點在于特異性較差(遺傳改變的CFDNA無法反應腫瘤類型和部位)，而且在非腫瘤患者中也會出現CFDNA的改變。進一步研究工作應該是尋找并確定具有最大預后和診斷價值的遺傳改變，以發揮優點克服不足。

參考文獻

[1]Leon SA,Shapiro B,Sklaroff DM,et al.Free DNA in the serum of Cancer patients and the effect of therapy[J].Cancer Res,1977,37(3):646-650.

[2]Xia S,Huang CC,Le M,et al.Genomic variations in plasma cell free DNA differentiate early stage lung cancers from normal controls[J].Lung Cancer,2015,90(1):78-84.

[3]Tabernero J,Lenz HJ,Siena S,et al.Analysis of circulating DNA and protein biomarkers to predict the clinical activity of regorafenib and assess prognosis in patients with metastatic colorectal Cancer:a retrospective,exploratory analysis of the CORRECT trial[J].Lancet Oncol,2015,16(8):937-948.

[4]Pinzani P,Salvianti F,Orlando C,et al.Circulating cell-free DNA in Cancer[J].Methods Mol Biol,2014,1160:133-145.

[5]Thierry AR,Mouliere F,El Messaoudi S,et al.Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA[J].Nat Med,2014,20(4):430-435.

[6]Wong BC,Lo YM.Cell-free DNA and RNA in plasma as new tools for molecular diagnostics[J].Expert Rev Mol Diagn,2003,3(6):785-797.

[7]Stroun M,Anker P,Lyautey J,et al.Isolation and characterization of DNA from the plasma of Cancer patients[J].Eur J Cancer Clin Oncol,1987,23(6):707-712.

[8]Lo YM,Zhang J,Leung TN,et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J].Am J Hum Genet,1999,64(1):218-224.

[9]Jahr S,Hentze H,Englisch S,et al.DNA fragments in the blood plasma of Cancer patients:quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells[J].Cancer Res,2001,61(4):1659-1665.

[10]Hibi K,Robinson CR,Booker S,et al.Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal Cancer patients[J].Cancer Res,1998,58(7):1405-1407.

[11]Diehl F,Li M,Dressman D,et al.Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(45):16368-16373.

[12]Anker P,Stroun M,Maurice PA.Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system[J].Cancer Res,1975,35(9):2375-2382.

[13]Xue X,Teare MD,Holen I,et al.Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum[J].Clin Chim Acta,2009,404(2):100-104.

[14]Devonshire AS,Whale AS,Gutteridge A,et al.Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma:controls for extraction efficiency,fragment size bias and quantification[J].Anal Bioanal Chem,2014,406(26):6499-6512.

[15]Keshavarz Z,Moezzi L,Ranjbaran R,et al.Evaluation of a modified DNA extraction method for isolation of Cell-Free fetal DNA from maternal serum[J].Avicenna J Med Biotechnol,2015,7(2):85-88.

[16]Mauger F,Dulary C,Daviaud C,et al.Comprehensive evaluation of methods to isolate,quantify,and characterize circulating cell-free DNA from small volumes of plasma[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(22):6873-6878.

[17]Kirk GD,Camus-Randon AM,Mendy M,et al.Ser-249 p53 mutations in plasma DNA of patients with hepatocellular carcinoma from The Gambia[J].J Natl Cancer Inst,2000,92(2):148-153.

[18]Barault L,Amatu A,Bleeker FE,et al.Digital PCR quantification of MGMT methylation refines prediction of clinical benefit from alkylating agents in glioblastoma and metastatic colorectal Cancer[J].Ann Oncol,2015,26(9):1994-1999.

[19]Wang Z,Chen R,Wang S,et al.Quantification and dynamic monitoring of EGFR T790M in plasma cell-free DNA by digital PCR for prognosis of EGFR-TKI treatment in advanced NSCLC[J].PLoS One,2014,9(11):110780.

[20]Allan JM,Hardie LJ,Briggs JA,et al.Genetic alterations in bronchial mucosa and plasma DNA from individuals at high risk of lung Cancer[J].Int J Cancer,2001,91(3):359-365.

[21]Ryan BM,Lefort F,Mcmanus R,et al.A prospective study of circulating mutant KRAS2 in the serum of patients with colorectal neoplasia:strong prognostic indicator in postoperative follow up[J].Gut,2003,52(1):101-108.

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.033

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1234-03

*基金項目：上海市衛生和計劃生育委員會科研課題計劃項目(201440470)。

作者簡介：瞿國英，女，副主任檢驗技師，主要從事臨床檢驗方向的研究。△通訊作者，E-mail：172327959@qq.com。