循環腫瘤細胞富集檢測的研究進展

周婧婷 綜述，戴啟宇 審校

(1.新鄉醫學院研究生院,河南新鄉 453000；2.中國人民解放軍第三七一中心醫院檢驗科,河南新鄉 453000)

?

·綜述·

循環腫瘤細胞富集檢測的研究進展

周婧婷1綜述，戴啟宇2△審校

(1.新鄉醫學院研究生院,河南新鄉 453000；2.中國人民解放軍第三七一中心醫院檢驗科,河南新鄉 453000)

關鍵詞:循環腫瘤細胞；富集檢測方法；納米技術

惡性腫瘤的復發和轉移是導致腫瘤患者死亡的重要原因。目前臨床上仍主要通過影像學檢查及傳統腫瘤標志物的檢測來發現并診斷腫瘤，發現時患者常常已處于腫瘤進展晚期，影響患者預后[1]。循環腫瘤細胞(CTCs)是從原發或轉移腫瘤病灶脫落，進入外周血的腫瘤細胞，與腫瘤的轉移密切相關，其檢測具有重要的臨床意義，不僅有助于實時監測腫瘤動態、早期發現腫瘤微轉移，還能為評估預后和療效以及腫瘤的個體化治療提供可靠參考[2]。近年來納米技術在CTCs的富集檢測中得到廣泛應用，本文對常用的CTCs富集檢測方法以及相關研究進展進行總結，并對納米技術在CTCs檢測中的應用進行探討。

1CTCs的生物學特性及其檢測的臨床意義

CTCs主要表達上皮源性表面標志，存在于大多數上皮來源的惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤中[3]。雖然CTCs在血液中水平極低，但是CTCs檢測是評估臨床預后及化療療效的重要指標。

2現有CTCs富集和檢測的方法學

外周血CTCs取材方便，重復性強，可實時監測癌細胞動態，相比較骨髓來說，是更為理想的檢測標本來源。外周血中白細胞水平較高，而CTCs的濃度極低，這就對其檢測分析技術提出了較高要求。現有的方法學主要分為CTCs分離富集方法和CTCs檢測鑒定方法兩大類[4]。

2.1CTCs分離富集方法

2.1.1物理富集方法物理富集方法是基于CTCs和血細胞之間直徑、密度、變形性、介電性質等物理學特性的不同而建立的方法。目前最常用的CTCs富集方法為膜濾過分析法和密度梯度離心法。這兩種方法分別根據CTCs直徑和密度與其他血細胞的差異，通過濾膜過濾法和離心法將CTCs分離出，并用于進一步的檢測鑒定。基于CTCs物理學特性的富集方法操作簡便，但特異度低，得到的CTCs純度較低，且存在被漏檢的可能[5]。細胞變形性富集法是利用腫瘤細胞的惡性程度增加，變形性增加這一特性而設計的一種微流體裝置進行細胞分離富集的方法。目前該方法應用于臨床仍有一定的困難。細胞電學特征富集法是根據細胞介電性質的不同而建立的分離富集方法。該方法具有活細胞分選、使用靈活、容易調控、便于自動化、可重復使用的優點。但是由于各種腫瘤細胞的介電性質不同，無法對所有腫瘤進行檢測。腫瘤細胞的尺寸和表面電荷與正常細胞存在差異，ApoStreamTM技術利用這一點通過改變電場頻率來捕獲CTCs[6]。ApoStreamTM技術的CTCs檢出率明顯高于CellSearch系統，有報道稱，ApoStreamTM技術檢出的CTCs數超過CellSearch系統的10倍以上[7]。

2.1.2生物富集方法生物富集方法是基于CTCs和普通血細胞之間某些生物標志物的表達差異而建立的方法。免疫磁性分離技術是目前最常用的CTCs分離富集方法[8]，其原理是形成抗原-抗體-磁珠免疫復合物，通過外加磁場作用使該復合物發生移動，達到分離細胞的目的，主要有陽性富集和陰性富集兩種[9]。CellSearch系統是目前唯一獲得美國FDA的批準應用于臨床檢測CTCs的新技術[10]。該技術通過上皮細胞黏附分子Ep-CAM標記磁珠從而對上皮細胞進行富集，目前已用于檢測結直腸癌、前列腺癌和轉移性乳腺癌CTCs[11]。該方法與免疫細胞化學技術、RT-PCR、流式細胞術(FCM)等方法相結合檢查CTCs，可提高檢測敏感度和特異度。CellSearch系統具有很好的重復性[12]，可以很好地保存細胞形態結構。缺點則是操作較為復雜，技術要求和檢測成本均較高。采用上皮細胞標志篩選將遺漏發生上皮間質轉化(EMT)的腫瘤細胞，造成結果的假陰性[13]。有研究者發現，增加的標記分子在提高CTCs檢出率的同時，其與正常細胞的特異性反應和非特異性反應也會增加，所以要求增加的標記分子特異度好、具有一定代表性[14-15]。

2.2CTCs檢測鑒定方法

2.2.1FCMFCM通過檢測細胞標記的熒光信號，從而實現高速、逐一的細胞定量分析和分選[16]。FCM可作為診斷癌前病變發展至癌變的一個重要標志，精確定量DNA水平的改變，對癌前病變的性質及發展趨勢做出評估，有助于癌變的早期診斷。FCM的優點是可以定量計數腫瘤細胞，可精確定量DNA水平。缺點是敏感度較低，檢測價值依賴于可分析細胞數量。

2.2.2免疫細胞化學技術免疫細胞化學技術方便、直觀，在細胞富集的基礎上，利用抗原抗體特異性結合的原理，對腫瘤細胞進行檢測及鑒定，但敏感度低，特異度較差。

2.2.3RT-PCRRT-PCR以上皮源性腫瘤細胞的mRNA為標志檢測CTCs，靈敏度高，價格較低，可重復操作，是目前檢測CTCs最有效的方法。缺點是無法計數，缺乏一定的特異度，易造成假陽性結果，在臨床應用上仍有局限性。

3納米技術在CTCs富集檢測中的應用

早期免疫磁珠技術磁珠大小只達到微米級，細胞分離效率較低，磁珠較難洗脫，不利于進一步分析。隨著技術的發展，磁珠的大小達到了納米級(10～100 nm)[17]，使其與細胞的接觸概率增加，大幅度提高了CTCs的富集率。但是捕獲了CTCs的納米磁珠易聚集，會影響細胞的形態及活性，不利于進一步分析檢測。

基于上述技術的缺點，非磁性納米材料在CTCs富集中的應用開始得到關注。研究者們將抗體功能化的不同形狀的納米材料固定在基底上富集CTCs，提高了細胞與納米材料的接觸概率。捕獲到的CTCs細胞較易洗脫，減少了對細胞形態及活力和進一步分析檢測的影響，從而進一步提高了CTCs細胞的富集率和檢測靈敏度，實現了CTCs富集檢測的一體化。

有研究者利用血細胞與腫瘤細胞在納米粗糙表面的不同黏附特性實現CTC的分離富集[18]。隨著粗糙度的增加，腫瘤細胞的黏附增多，而正常細胞不受影響。避免了因特異性抗原丟失所導致的假陰性結果，提高了檢測的準確性。

血液中CTCs水平相對于白細胞來說極少，這便成為CTCs富集檢測中的首要困難。微流控芯片具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度高等特點。有研究者將納米材料與微流控技術相結合[19]，構建一種腫瘤細胞表面特異性識別抗體功能化的魚骨形芯片，使血液流過一個可視通道，通道內魚骨形溝回能夠引起血液的一個輕微斡旋，從而增強了其與抗體修飾表面的接觸。該技術不用對血液樣本進行預處理，操作方便，靈敏度更高，且獲得的CTCs仍能夠保持活性，用于進一步分析檢測。

4CTCs富集檢測在臨床應用存在的問題和前景

CTCs檢測是一種新型的診斷工具，屬于非侵入性操作，但也有一定的弊端。如外周血中CTCs數量稀少，且具有異質性、易聚集成團。已有微流控技術與納米材料聯合應用的相關研究[20]，尋找新的特異性標志或多種檢測技術的聯合應用是必然的發展趨勢。隨著技術的發展進步，已經研究出可觀的新方法，但是關于CTCs的臨床實用性的評估仍是必不可少的，還需要建立規范的實驗流程使其標準化。CTCs檢測技術成本較高也是需要解決的一個重要問題。隨著研究的不斷深入和未來科技的發展，CTCs檢測勢必在臨床腫瘤的診治過程中得到廣泛應用，其檢測的同時所伴隨的問題也會不斷的改進與解決，其檢測方法的更加高效、經濟、快速是必然的趨勢。

參考文獻

[1]郭浩,劉劍新.TCT在泌尿系上皮腫瘤診斷中的應用進展[J].浙江醫學,2014，20(2)：135-136.

[2]申珊珊.循環腫瘤細胞(CTCs)在監測腫瘤轉移中的應用[C].北京：第十四屆全國腫瘤生物治療大會論文集,2015:105-106.

[3]楊卓,張玉娟,陳倩,等.循環腫瘤細胞檢測及其特性[J].協和醫學雜志,2013,4(2):191-194.

[4]張玉娟.循環腫瘤細胞檢測的方法學建立和改良及在實體瘤中的監測應用研究[D].北京：北京協和醫學院,2014.

[5]戚大梁,王強,易維京.循環腫瘤細胞檢測方法和技術研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2012,33(24):3022-3024.

[6]Gupta V,Jafferji I,Garza M,et al.ApoStreamTM,a new dielectrophoretic device for antibody independent isolation and recovery of viable cancer cells from blood[J].Biomicrofluidics,2012,6(2):24133.

[7]王瑩,梁硯菲,陶敏.循環腫瘤細胞的生物學特性及其檢測方法和應用進展[J].廣西醫科大學學報,2014,31(2):329-332.

[8]嵇金陵,何曉東,索美芳,等.利用新型免疫磁珠富集原理檢測肺癌患者外周血循環腫瘤細胞[J].中華檢驗醫學雜志,2013,36(8):727-732.

[9]李媛,宋麗華,宋現讓.小細胞肺癌患者循環腫瘤細胞檢測技術及應用現狀[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(10):793-796.

[10]Truini A,Alama A,Coco S,et al.Clinical applications of circulating tumor cells in lung cancer patients by cell search system[J].Front Oncol,2014,20(4):242.

[11]Cohen SJ,Punt CJ,Nicholas I,et al.Relationship of circulating tumor cells to tumor response,progression-free survival,and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer[J].J of Clin Onco,2008,26(19):3213-3221.

[12]Frithiof H,Welinder C,Larsson AM,et al.A novel method for downstream characterization of breast cancer circulating tumor cells following cell search isolation[J].Jour Trans Med,2015,13(1)：200-202.

[13]趙麗娜,蔡莉.乳腺癌循環腫瘤細胞研究進展與展望[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(22):1810-1815.

[14]Isabelle D,Guerrouahen BS,Naoual BF,et al.A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells.[J].Anticancer Research,2011,31(2):427-441.

[15]龔學軍.CEA 及 CK20 的不同檢測方法對結直腸癌診斷及預后評估的初步探討[D].長沙：中南大學,2010.

[16]史珂瑋,劉春芳.循環腫瘤細胞與腫瘤惡性行為間的關系[J].標記免疫分析與臨床,2014,21(5):603.

[17]Li FR,Li Q,Zhou HX,et al.Detection of circulating tumor cells in breast cancer with a refined immunomagnetic nanoparticle enriched assay and nested-RT-PCR[J].Nano Med,2013,9(7):1106-1113.

[18]Chen W,Weng S,Zhang F,et al.Nanoroughened surfaces for efficient capture of circulating tumor cells without using capture antibodies[J].Acs Nano,2013,7(1):566-575.

[19]Stott SL,Chia-Hsien H,Tsukrov DI,et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010,107(43):18392-18397.

[20]劉玉磊.基于納米材料的微流控技術在 HIV 和 HCV 檢測中的應用研究[D].北京：中國疾病預防控制中心,2012.

(收稿日期：2015-12-24)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.035

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1239-02

作者簡介：周婧婷，女，在讀研究生，主要從事循環腫瘤細胞檢測的研究。△通訊作者：E-mail：dqy716@sohu.com。