流式細胞術(shù)在冠心病患者診療中的作用研究進展

顧　進 綜述，顧蕓蕓，仲崇明 審校

(連云港市中醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港 222004)

?

·綜述·

流式細胞術(shù)在冠心病患者診療中的作用研究進展

顧進 綜述，顧蕓蕓，仲崇明 審校

(連云港市中醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港 222004)

關(guān)鍵詞:流式細胞術(shù)；冠心病；診療

冠心病是危害人類健康與生命的心血管疾病，其基本病理變化是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死。世界衛(wèi)生組織將冠心病分為5大類：無癥狀心肌缺血(隱匿性冠心病)、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心臟病)和猝死5種。臨床上又常分為穩(wěn)定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征。流式細胞術(shù)(FCM)是一種通過熒光染料標記對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它綜合了光學、電子學、流體力學、免疫學、細胞化學、計算機等多門學科為一體，是當代最先進的細胞分析技術(shù)。其特點是測量速度快，可進行多參數(shù)測量且既是細胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。由于冠心病的動脈粥樣硬化的斑塊是處于動態(tài)變化的過程，所以醫(yī)學影像學的靜態(tài)局部檢測往往具有局限性，這使得非入侵性的血液學檢測其相關(guān)標記物來預(yù)測動脈粥樣硬化斑塊的動態(tài)成為一種能夠彌補影響學局限性的重要方法。而且近年來，隨著FCM的發(fā)展和普及，血液學檢測相關(guān)標記物變得越來越簡單易行。本文對近些年使用FCM在冠心病患者中的使用進行綜述。

1淋巴細胞分析與冠心病的關(guān)系

炎癥和免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，因此與冠心病有著密切的聯(lián)系。冠心病的炎癥可能不僅僅局限于血管壁，而且包括全身免疫系統(tǒng)的反應(yīng)[1]。T 淋巴細胞亞群是公認的機體免疫反應(yīng)的敏感指標，所以T 淋巴細胞亞群與冠心病的關(guān)系也非常密切。湯涌等[2]采用FCM測定 T淋巴細胞亞群(CD4、CD8、CD4/CD8)發(fā)現(xiàn)，T細胞亞群中CD4細胞數(shù)量在早發(fā)冠心病中明顯異常,CD4/CD8異常代表的免疫功能紊亂在早發(fā)冠心病中起著重要的作用。聶大奧等[3]研究的結(jié)果也顯示冠心病患者 CD3+細胞占淋巴細胞比例明顯高于正常非冠心病患者人群；不穩(wěn)定型心絞痛組以及急性心肌梗死組CD4+及CD8+細胞占CD3+細胞比例明顯異常于穩(wěn)定型心絞痛患者；通過外周血T細胞與 Gensini 評分表明機體免疫功能紊亂可能參與急性心肌梗死的發(fā)生，間接或直接引起梗死面積擴大或并發(fā)癥的發(fā)生。另外研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，CD4+CD28-T細胞在穩(wěn)定性斑塊中不存在，僅存在于不穩(wěn)定性斑塊，提示 CD4+CD28-T細胞與斑塊破裂有直接的關(guān)系，其原因可能是由于動脈粥樣斑塊中的大部分 T 細胞包括CD4+CD28-T細胞分泌γ-IFN，促進巨噬細胞分化為泡沫細胞及其他抗原提呈細胞可引起斑塊破裂。有學者認為[6-7]，CD4+CD25+Treg 是一個具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的 T 細胞亞群，人體主要通過CD4+CD25+Treg 以免疫負向調(diào)節(jié)的方式來抑制自身反應(yīng)性 T 細胞的作用，減少免疫性疾病的發(fā)生，從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，維持免疫耐受，而在冠心病中其比例降低導致機體免疫功能紊亂，從而參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展。

T細胞表面CD31是血管內(nèi)皮細胞(EPC)集落形成和構(gòu)成中央集群必不可少的分子，而EPC是冠狀動脈疾病(CAD)的一個重要標志，若EPC減少會造成心血管疾病的風險增加[8]，因此，EPC被認為是預(yù)測冠狀疾病的生物學標記。盡管CD31分子在CAD中的臨床意義仍不清楚，但是Flego等[9]發(fā)現(xiàn)在急性冠脈綜合征患者體內(nèi)，若T細胞表面CD31分子的抑制活性喪失后，體內(nèi)會出現(xiàn)一種免疫球蛋白樣的黏附分子，從而導致實驗?zāi)Ｐ彤a(chǎn)生動脈粥樣硬化樣的改變，因此Flego等[9]通過流式檢測急性冠脈綜合征患者體內(nèi)T細胞表面CD31的表達以及其在TCR信號傳導中的作用，發(fā)現(xiàn)在患者體內(nèi)總的CD4+T細胞和CD4+CD28null T細胞表面的CD31表達均降低，且相比穩(wěn)定性心絞痛患者，急性冠脈綜合征患者體內(nèi)CD31對TCR信號傳導的免疫調(diào)節(jié)效果更差。該結(jié)果提示CD31可以作為一個新穎的靶分子來治療急性冠脈綜合征患者T細胞異常。因此，Kakizaki等[10]針對這種問題提出增加急性冠脈綜合征患者體內(nèi)的CD3+/CD31+T細胞。

T淋巴細胞上有3個絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(MAPK)信號通路，他們是ERK1/2，JNK 和p38。研究者通過評估這個通路的活性[11]，采用FCM檢測磷酸化后的ERK1/2，JNK 和p38，他們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性心絞痛患者磷酸化的JNK與對照組相比，沒有明顯的改變；而ERK1/2明顯增高。非ST段抬高型心絞痛和ST段抬高型心絞痛的患者磷酸化的ERK1/2、JNK均明顯增高。除了穩(wěn)定型冠狀動脈疾病(CAD)患者，所有的急性冠脈綜合征患者(ACS)的p38都增高了。這些結(jié)果可以作為診斷不穩(wěn)定性心絞痛的特異性生物學標記。

有學者在患有冠狀動脈疾病患者的外周血中可以檢測到OxLDL和HSP-60抗原特異性CD8+T淋巴細胞[12]，OxLDL和HSP-60抗原通過刺激斑塊內(nèi)的淋巴細胞從而成為冠心病的發(fā)病原。作者用p/MHC五聚體復合物染色經(jīng)過FCM檢測，結(jié)果在健康人體內(nèi)OxLDL和HSP-60抗原特異性T細胞不能被檢測到，而在穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛患者的外周血中這兩種抗原的特異性T細胞能夠被檢測到。這個發(fā)現(xiàn)使得人們認識到OxLDL和HSP-60抗原特異性CD8+T細胞在動脈粥樣硬化冠狀動脈疾病中也起到一定的作用。

2單核細胞分析與冠心病的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者CD14++CD16+單核細胞以及總的CD16+的單核細胞水平顯著增高，且總的CD16+的單核細胞水平與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[13]。Tallone等[14]發(fā)現(xiàn)冠心病患者體內(nèi)CD14+CD16++單核細胞增高了90%，且鑒于Tallone等[14]的研究結(jié)果，楊國紅等[15]建立基于四色的FCM檢測外周血單核細胞亞群及各亞群單核細胞-血小板聚集體(MPA)的方法，并觀察冠心病患者外周血單核細胞亞群及各亞群MPA的變化特點。他們采集冠心病患者的外周靜脈血依據(jù)單核細胞和血小板的標志性分子CD86、CD14、CD16和CD41對單核細胞亞群和MPA進行四色的流FCM分析并利用Flow-countTM熒光微球?qū)魏思毎麃喨杭案鱽喨核纬傻腗PA進行絕對計數(shù)，該方法重復性好，結(jié)果可靠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病組患者外周血CD14++CD16+和CD14+CD16++所占百分比和絕對計數(shù)均顯著高于對照組，冠心病患者總MPA以及CD14++CD16+相關(guān)的MPA所占百分比和絕對計數(shù)也顯著增高，結(jié)果提示中間型單核細胞及其形成的MPA可能是臨床上冠心病患者的一個潛在的診斷和治療靶點。

秦光明等[16]利用FCM對冠心病患者進行單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCP-1有上升，但是靈敏度不高，尚不如IL-6等細胞因子，還不能作為冠心病嚴重程度的估計和預(yù)測。但張錄站等[17]研究認為早發(fā)冠心病患者MCP-1水平明顯增高，是斑塊不穩(wěn)定的標志之一。而王鋒劍等[18]研究認為急性冠狀動脈綜合征患者TLR4和MCP-1水平呈正相關(guān)，推測MCP-1可能與動脈硬化相關(guān)。目前關(guān)于MCP-1與冠心病的研究較少，結(jié)論也不太一致，需要更多的研究來明確其在冠心病中的應(yīng)用價值。

另外，由于 Toll樣受體分布廣泛，主要表達于單核細胞表面，屬模式識別受體，TLRs最突出的生物學功能是促進細胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎性反應(yīng)。研究認為 TLR4與心血管疾病關(guān)系最為密切[19]。通過對人及小鼠模型的動脈粥樣硬化組織切片進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)TLR4在粥樣斑塊組織表達，尤其在巨噬細胞浸潤、脂質(zhì)豐富的部位明顯表達。當損傷和硬化的動脈處存在有內(nèi)源性配體如低度修飾的低密度脂蛋白(mmLDL)時，TLRs通路即被活化，啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，最終激活核因子κB(NF-κB)，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。免疫炎性反應(yīng)不僅是動脈粥樣硬化的觸發(fā)因素，而且是造成斑塊不穩(wěn)定的重要因素之一。趙順鋒[20]采用FCM檢測外周血單核細胞 TLR4表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病患者TLR4表達上調(diào)，提示 TLR4及其介導的炎性反應(yīng)與冠心病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

清道夫受體參與血管炎疾病的發(fā)生和發(fā)展過程已經(jīng)被證實，但其機制尚不明確。Piechota等[21]研究清道夫受體CD36和MSR1在冠心病患者出現(xiàn)癥狀后以及治療第六個月后的表達情況，通過FCM和定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)所有有癥狀的急性冠脈綜合征患者體內(nèi)單核細胞上的CD36和MSR1 mRNA的數(shù)量及其密度都顯著增高。經(jīng)過6個月的阿托伐他汀治療后，CD36和MSR1 的表達水平有了明顯的下降。該研究表明清道夫受體也參與了ACS的發(fā)生、發(fā)展。

3血小板功能分析與冠心病的關(guān)系

在冠狀動脈粥樣硬化、斑塊破裂乃至血栓生成過程中，血小板活化和血小板聚集起了舉足輕重的作用[22]。其原因是在正常血液循環(huán)中，大量血小板幾乎均處在休眠狀態(tài)，當受生理或病理刺激時，血小板發(fā)生活化，在相當一部分血小板膜上表達出一種或多種活化血小板分子標志代表物。

血小板CD62P(P選擇素)是一種細胞黏附分子，存在于內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體和血小板的α顆粒中，是血小板活化的一個特征性指標，在炎性反應(yīng)和血栓形成中起著中心調(diào)控作用，當血小板被活化時，CD62P迅速從胞內(nèi)翻轉(zhuǎn)至細胞表面，表達明顯升高[23]，所以是血小板活化的重要標志。CD41是血小板質(zhì)膜表面變化的GPⅡb/Ⅲa糖蛋白表位，在血小板活化時才因構(gòu)象變化而暴露出來，是血小板活化早期的標志物。由于在生理和病理情況下，血小板群和紅細胞群的大小、顆粒度會有交叉。因此，采用CD41/CD62雙染色計算血小板CD62表達陽性率，能準確地區(qū)分血小板群，從而更敏感而精確地檢測血小板的活化狀況[24]。任澎等[25]選擇40例冠狀動脈綜合征患者采用FCM測定其應(yīng)用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療前后血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和P選擇素(CD62P)水平的變化，并與正常組進行比較。檢測結(jié)果表示發(fā)現(xiàn)ACS患者聯(lián)合抗血小板治療前后血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P 的表達均明顯高于對照組，表明AMI 患者有明顯的血小板活化，提示ACS患者體內(nèi)血小板的黏附、聚集、釋放反應(yīng)均增高。同時血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P 的表達是很好的血小板聚集功能的檢測指標，在藥物治療的過程中需要連續(xù)監(jiān)測。

龔曉璇等[26]首次在國內(nèi)建立了用FCM測定血小板COX-1、COX-2表達的方法，采用FCM檢測時，因PE-CD42b抗體能特異性識別血小板膜糖蛋白，故在FITC-COX-1、FITC-COX-2抗體與COX-1、COX-2結(jié)合的基礎(chǔ)上，再用PE-CD42b標記識別血小板，避免了源于血樣中的其他成份如白細胞等外源性COX-1、COX-2的干擾。因此，使用FCM檢測血小板COX-1、COX-2較Western blot等方法具有更高的特異性，可以提升在冠心病中的診斷價值。

4細胞因子檢測與冠心病的關(guān)系

血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)為細胞表面單鏈糖蛋白，分布于內(nèi)皮細胞、白細胞、單核細胞、成纖維細胞、巨噬細胞表面，sVCAM-1是VCAM-1的可溶性形式。VCAM-1主要是介導細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)黏附，參與多細胞生物體各種生理、病理過程。在冠狀動脈粥樣硬化炎癥過程發(fā)生發(fā)展的各個階段都扮演著重要的角色[27]。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是迄今發(fā)現(xiàn)的具有特異性促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，在促進血管生成、再生和抗動脈硬化及治療中發(fā)揮著重要的作用。

馬愛玲等[28]研究急性冠狀動脈綜合征患者與穩(wěn)定性冠心病患者和健康人比較，急性冠狀動脈綜合征患者的VCAM-1和VEGF水平顯著高于穩(wěn)定性冠心病患者和健康人。胡萍[29]研究認為冠心病患者血清中VCAM-1和VEGF的水平顯著高于健康人群，同時3支病變患者VCAM-1和VEGF水平高于單支和雙支病變組，因此黏附分子水平可以判斷冠脈病變數(shù)目和病變程度。鄭金鼎等[30]研究認為VCAM-1和VEGF在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，對冠心病的診斷和分層有一定的臨床價值，同時用流式細胞技術(shù)是可以準確方便地進行定量檢測。因此，利用FCM檢測VCAM-1和VEGF對冠心病患者的臨床診療有著非常好的作用和價值。

5展望

冠心病實際是炎癥介導和免疫反應(yīng)的過程，斑塊內(nèi)激活的內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞及平滑肌細胞都能通過旁分泌和自分泌作用產(chǎn)生各種活性物質(zhì)如細胞因子、黏附分子、蛋白水解酶等一系列炎癥免疫反應(yīng)物質(zhì)，促進平滑肌減少和細胞外基質(zhì)降解，導致斑塊不穩(wěn)定破裂和血栓形成。因為這是一個動態(tài)的過程，所以用影像學靜態(tài)局部檢測往往具有很大的局限性。而可以通過FCM檢測不同時間段的相關(guān)生物學標記物，能夠盡早的預(yù)測觀測動脈粥樣斑塊的變化程度，為防止斑塊破裂提供預(yù)防和診斷的線索。同時通過FCM檢測冠心病患者體內(nèi)的生物學標志物，臨床上可以用來評估藥物的療效。因此，目前FCM在冠心病檢測方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，其準確性不但可以評估冠心病的輕重程度，還可以成為藥物治療療效的指標之一。

FCM發(fā)展迅速，具有自身特點及其應(yīng)用優(yōu)勢，目前多方面應(yīng)用于冠心病的研究，在該病的病情評估，指導臨床治療、療效觀察及探索發(fā)病機制等方面有一定的作用及地位。隨著FCM技術(shù)的不斷發(fā)展，未來在冠心病的研究中將會發(fā)揮更重要的作用，為該病的檢測和綜合防治提供新的方向。

參考文獻

[1]Baidya SG,Zeng QT.Helper T cells and atherosclerosis:the cytokine web[J].Postgrad Med J,2005,81(962):746-752.

[2]湯涌,陸治平,黃進.早發(fā)冠心病患者淋巴細胞亞群分析[J].四川醫(yī)學,2010,31(7):984-985.

[3]聶大奧,趙一俏,靳文,等.外周血 T 細胞亞群構(gòu)成比例與冠狀動脈粥樣硬化的關(guān)系[J].中國動脈硬化雜志,2013,21(6):532-536.

[4]馮靜，費瑜，孟曉萍，等．CD4+和CD8+T 淋巴細胞與動脈粥樣硬化相關(guān)性研究進展[J]．中國動脈硬化雜志，2011，19(8)：707-710.

[5]Shi B,Du X,Wang Q,et al.Increased PD-1 on CD4+CD28-T cell and soluble PD-1 ligand-1 in patients with T2DM:association with atherosclerotic macrovascular diseases[J].Metabolism,2013,62(1):778-785.

[6]殷令妮，蔡文瑋．CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與冠狀動脈粥樣硬化病變的研究進展[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12(19)：3748-3750.

[7]徐林杰，吳繼雄，許邦龍,等．急性冠脈綜合征患者外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T 細胞的變化及意義[J].安徽醫(yī)科大學學報,2014,49(5):637-640.

[8]Wang CH,Hsieh IC,Cherng WJ,et al.Differentiation profile of peripheral blood-derived vascular progenitor cell predicts intimal hyper-plasia after coronary stenting[J].Heart Vessels,2012,27(1):10-19.

[9]Flego D,Severino A,Trotta F,et al.Altered CD31 expression and activity in helper T cells of acute coronary syndrome patients[J],Basic Res Cardiol,2014,109(6):448.

[10]Kakizaki M,Nobori K,Watanabe H,et al.Increased circulating CD3+/CD31+T cells in patients with acute coronary syndrome[J].Heart Vessels,2013,28(5):566-569.

[11]Indolfi C,Gasparri C,Vicinanza C,et al.Mitogen-activated protein kinases activation in T lymphocytes of patients with acute coronary syndromes[J].Basic Res Cardiol,2011,106(4):667-679.

[12]Ghio M,Fabbi P,Contini P,et al.OxLDL- and HSP-60 antigen-specific CD8+T lymphocytes are detectable in the peripheral blood of patients suffering from coronary artery disease[J].Clin Exp Med,2013,13(4):251-255.

[13]Hristov M,Weber C.Differential role of monocyte subsets in atherosclerosis[J].Thromb Haemost,2011,106(5):757-762.

[14]Tallone T,Turconi G,Soldati G,et al.Heterogeneity of human monocytes:an optimized four-color flow cytometry protocol for analysis of monocyte subsets[J].J Cardiovasc Transl Res,2011,4(2)：211-219.

[15]楊國紅，盧芮伊，孫海英，等．四色流式分析冠心病患者外周血單核細胞亞群及單核細胞-血小板聚集體的變化[J]．臨床心血管病雜志，2013，29(1)：29-33．

[16]秦光明,金亞平,王俊宏,等.流式細胞術(shù)檢測冠心病患者七種循環(huán)標志物的應(yīng)用研究[J].中華檢驗雜志，2006,29(7)：615-617.

[17]張錄站,陳忠,馬根山.早發(fā)冠心病患者血漿MCP-1水平檢測及其臨床意義[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2008，36(3):170-173.

[18]王鋒劍，李保，王馨.Toll 樣受體4 和單核細胞趨化蛋白1 與急性冠狀動脈綜合征的相關(guān)性研究[J].中國心血管雜志,2013,18(2):89-92.

[19]Ishikawa Y,Satoh M,Itoh T,et al.Local expression of Toll-like receptor 4 at the site of rup tured p laques in patientswithacute myocardial infarction[J].Clin Sci(Lond),2008,115(4):129-131.

[20]趙順鋒.冠心病患者外周單核細胞TLR4表達及其與血漿P選擇素的相關(guān)性[J].臨床輸血與檢驗,2010,12(4):328-330.

[21]Piechota M,Banaszewska A,Dudziak J,et al.Highly upregulated expression of CD36 and MSR1 in circulating monocytes of patients with acute coronary syndromes[J].Protein J,2012,31(6):511-518.

[22]Gianetti J，Parrim S，Sbrana S，et al．Platelet activation predicts recurrent ischemic events after percutaneous coronary angioplasty：a 6 months prospective study[J]．Thromb Res，2006，118(4)：487-493.

[23]蔡裕福,李平,李存仁,等.冠心病患者不同治療階段GPⅡb/Ⅲa、CD62P 狀態(tài)的變化及臨床價值[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2014,8(24):4366-4369.

[24]莫文宏,楊帆,王紅,等.冠心病患者血小板 CD41+CD62+與胱抑素 C 的相關(guān)性研究[J].實用醫(yī)學雜志,2012,28(20):3369-3371.

[25]任澎,張冰,馬麗,等.急性冠狀動脈綜合征患者血小板膜糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 和P 選擇素水平的變化[J].中國心血管雜志,2014,19(3):176-179.

[26]龔曉璇，張錦英，張秋,等.血小板環(huán)氧化酶及 P-選擇素的檢測及其在冠心病患者中的表達[J].南京醫(yī)科大學學報:自然科學版,2012,32(7):948-951.

[27]Kaptoge S,Seshasai SR,Gao P,et al.Inflammatory cytokines and risk of coronary heart disease:new prospective study and updated meta-analysis[J].Eur Heart J,2011,35(9)：578-589.

[28]馬愛玲,邵寧,伊善喜,等.急性冠狀動脈綜合征患者血清ICAM-1、VCAM-1及CD40L水平及葛根素對其的影響[J].臨床心血管病雜志，2014，30(6)：492-494.

[29]胡萍.冠心病患者血清黏附分子含量檢測及對病變嚴重程度的判斷價值[J].海南醫(yī)學院學報,2015,21(7):891-894.

[30]鄭金鼎,令狐穎,黃山,等.P-selectin、VCAM-1和VEGF三種細胞因子標志物聯(lián)合檢測對冠心病的診斷價值探討[J].貴州醫(yī)藥,2011,35(1):8-10.

(收稿日期：2016-01-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.036

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1241-03

作者簡介：顧進，女，主任技師，主要從事醫(yī)學免疫學研究。