MAPK信號通路與急性肝衰竭發病機制的研究進展

王蓋昊 于曉輝

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·綜 述·

MAPK信號通路與急性肝衰竭發病機制的研究進展

王蓋昊 于曉輝

急性肝衰竭(ALF)的發生是多種因素共同作用引起的結果，具體的分子生物學致病機制也較為復雜，其中肝細胞的變性和壞死是通過多種信號通路來實現的。絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)是目前研究較多的一條，它與細胞的炎性損傷有關，尤其與肝細胞炎癥和壞死的發生密切相關。

急性肝衰竭具有起病急、病情發展迅速、死亡率高等特點，其發病因素多種多樣，除了HBV/HCV感染外，酒精、藥物、肝毒性物質等也是常見病因。故對于該病發病機制的研究是目前的熱點之一，這將對于臨床醫生深刻認識此病，提高其診治水平，特別是其發生機制的分子靶點作為藥物研發具有重要意義。而其發生的分子機制涉及到多種信號通路，其中MAPK通路就是與肝細胞衰竭有關的重要一條，本文就MAPK信號通路的活化與急性肝衰竭的發生進行如下綜述。

一、急性肝衰竭發病機制的研究

急性肝衰竭是由多種因素引起的嚴重肝臟損害，進而導致肝臟本身的合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發生嚴重障礙的癥候群，其病因復雜，病情發展迅速，病死率極高。有研究顯示，HBV相關性急性肝衰竭的發生與發展主要受病毒和宿主兩方面因素及其相互作用影響，其中病毒誘發的機體免疫性病理損傷引起的大量肝細胞死亡在急性肝衰竭發生的過程中有著重要作用。Ye等[1]提出了在乙型病毒性肝炎致肝衰竭中的三重打擊學說：免疫損傷、缺血缺氧損傷和內毒素血癥損傷。雖然這一學說目前被大多數人所認可，但是急性肝衰竭發生的具體機制如參與炎癥反應的信號通路的分子機制等還未完全研究清楚。

二、MAPK信號通路概述

MAPK是一類存在于真核細胞內具有高度保守的信號轉導分子，同時是一個連接胞內胞外反應的關鍵蛋白，其介導將細胞膜外刺激信號傳入細胞內，調節細胞生長、分化、遷移、炎癥等過程[2,3]。在哺乳動物中，MAPK家族信號通路主要有細胞外信號調節激酶(ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)和p38 MAPK三條途徑。ERK、JNK和p38 MAPK可以由不同的刺激因素所激活，進而形成不同的轉導通路，但這幾條通路存在著廣泛的“cross talk”。多種胞外刺激因素可以激活MAPK信號通路，主要有炎性細胞因子、生長因子、物理刺激以及細菌復合物等。MAPK信號通路轉導主要是以三級激酶級聯反應方式進行的，其級聯的核心是由三個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MAPKKK、MAPKK和MAPK組成；其級聯方向是MAPKKK-MAPKK-MAPK。細胞外刺激信號作用于細胞，然后對蘇氨酸/酪氨酸雙位點磷酸化激活MAPK，激活的MAPK轉入核內磷酸化轉錄因子、細胞骨架蛋白和酶類等調節細胞增殖、分化、凋亡等基本生理過程以及發生炎癥、腫瘤等病理過程。

三、ERK信號通路與急性肝衰竭

ERK亞家族包括5個成員，即ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和ERK5/BMK1(big mitogen activated protein kinase 1)。目前，ERK1/2(p44 MAPK和p42 MAPK)信號轉導通路過程及生物學意義研究較為深入，而ERK3、ERK4和ERK5信號通路的激活方式、轉導過程及影響生物學意義尚未明確。靜息狀態時，ERK1/ERK2位于胞質中不執行生物學功能；當其接受細胞外信號刺激后磷酸化后入核，調節相關基因轉錄。ERK1/ERK2信號通路由MAPK激酶MEK所激活，RAS可引起下游MEK磷酸化，從而誘發細胞增殖、分化、轉錄和生長過程[4]。HIF(hypoxia inducible factor)-1即缺氧誘導因子，在機體缺氧時起到自我平衡作用，可介導機體炎癥反應[5]。大量研究提示Ras-Raf-ERK通路可促進HIF-1a的表達，急性肝衰竭時肝細胞大量壞死誘發低氧環境，通過ERK通路激活HIF-1，產生大量促炎因子。由此推斷，ERK信號通路可能是急性肝衰竭發病機制之一。

Sutton等[6]發現ERK1的高表達可顯著提高HIF-1的活性。另有研究表明，抑制ERK磷酸化可通過增強HIF-1a泛素化作用，并抑制HIF-1a進入細胞核。在CCl4誘發的肝纖維化模型研究中，發現姜黃素通過抑制ERK通路減弱HIF-1a的活性，起到改善肝纖維化的作用[7]。異煙肼在治療肺結核的同時可能會引起嚴重肝損害甚至肝衰竭，近期有人將其引起肝損害機制進行了細胞學研究。Verma AK[8]在異煙肼損傷Hep 3B細胞研究結果中表明，異煙肼通過氧化應激反應促進凋亡和通過增加p-ERK蛋白表達促進Nrf2易位到肝細胞核從而破壞肝細胞，可見ERK信號通路可能參與了異煙肼誘導的Hep 3B細胞損傷。Liu H[9]在研究沙棘多糖(HRP)對D-GalN聯合LPS誘導的急性肝衰竭小鼠保護效應機制中發現轉氨酶和炎癥因子TNF-α、IL-1β降低，肝組織炎癥減輕，TLR4、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK和NF-κB蛋白表達降低，提示了HRP通過TLR4-NF-κB信號通路減輕D-GalN聯合LPS誘導的急性肝衰竭的炎癥和壞死，由此推斷MAPK信號通路可能在TLR4-NF-κB信號通路中起到橋梁作用。但是，Zhang F[10]研究柴胡皂苷D引起人正常肝細胞(LO2)毒性反應機制時發現，Fas死亡受體和Bid活化參與了LO2細胞誘導的線粒體凋亡機制，而其沒有明顯影響ERK信號通路在LO2細胞發生毒性時的調節作用。

四、JNK信號通路與急性肝衰竭

JNK也被稱為應激活化蛋白激酶(SAPK)，分為JNK1、JNK2和JNK3三種蛋白，可被細胞因子、生長因子和應激反應所激活。大量研究表明，肝臟組織中主要表達JNK1和JNK2，JNK信號通路可調節肝細胞生長[11]，同時二者可通過死亡受體和ER凋亡應激通路或依賴caspase活性氧介導的細胞死亡通路促進肝細胞死亡[12]。急性肝衰竭發生發展過程中的核心事件是大量肝細胞發生凋亡和壞死。持續JNK1活化可促進cFLIP(死亡受體信號內源性受體)降解，由此借助TNFR1、Fas或TRAIL受體促進細胞死亡。而Harmeet[12]研究表明，短暫的JNK活化可能促進細胞活化,持續的JNK活化可促進細胞死亡，其主要由Bcl-2家族蛋白調制和線粒體透化作用實現。且JNK1和JNK2在調控不同原因所致肝臟損傷方面各有優勢作用[13-15]。

近年來許多實驗表明JNK在介導藥物所致肝損傷過程中起重要作用。最近Gunawan等[16]在研究對乙酰氨基酚(APAP)引起小鼠肝細胞毒性模型中發現APAP可介導持續的JNK活化，促進肝細胞發生壞死，而在基因水平上用反義寡核苷酸干擾JNK1和JNK2來抑制JNK功能仍可對抗APAP的毒性作用。這些發現表明，APAP對肝臟的毒性作用是由JNK介導的信號途徑的活化而引起，JNK介導的信號通路活化是肝細胞壞死必需的過程。Wu YL等[17]通過給小鼠體內注入D-GalN/LPS制作急性肝衰竭模型，于造模1 h前給予黃芩素保肝預防治療，造模6 h后小鼠處死，發現黃芩素可降低AST、ALT、NO、iNOS和TNF-α的表達，結果提示了黃芩素可抑制D-GalN/LPS的促凋亡機制與保護線粒體通過增加Bcl-2/Bax比率、減少胞質細胞色素C釋放和抑制ERK、JNK的磷酸化作用。Jan等[18]在研究內毒素誘導小鼠肝衰竭的發病機制時發現P38α和IκB激酶2(IKK2)蛋白缺乏，JNK激活可引起TNF誘導的肝細胞損傷，提示了P38α結合IKK2通過抑制JNK蛋白表達而阻止LPS誘導的肝細胞發生衰竭。Takamura等[19]應用GalN/LPS構建小鼠肝衰竭模型發現GaIN/LPS可導致JNK信號通路持續激活，進一步應用JNK抑制劑SP600125進行分析發現，SP600125不僅阻止了細胞色素C的釋放，而且抑制了caspase-9和caspase-3的活性。同時發現在注射GalN/LPS的早期，SP600125下調了Bad的mRNA水平和蛋白表達，而晚期則抑制了Bid的剪切，這些實驗結果說明JNK信號通路在GalN/LPS誘導的肝衰竭凋亡中發揮重要作用。有人利用兔出血熱病毒所致肝衰竭動物模型，其模型在生化、組織學結構和臨床特征上與人類急性肝衰竭基本相似[20]，實驗結果發現感染兔出血熱病毒12 h后JNK1表達增高并且于24～48 h時維持在最大濃度，JNK1的持續活化在介導細胞死亡中先于AP-1和NF-κB的活化，說明JNK信號通路在調節肝衰竭細胞壞死的過程中起著關鍵的作用[21]。

五、p38 MAPK信號通路與急性肝衰竭

p38 MAPK是MAPK家族中另一的重要成員，1994年Han在小鼠肝臟組織中成功克隆出p38 MAPK基因，其編碼的蛋白被證實含有360個氨基酸殘基，分子量為38 kDa，所以命名為p38 MAPK。p38 MAPK 可以由細胞外的多種應激( 包括紫外線、放射線、熱休克、促炎因子、特定抗原及其他應激反應)激活磷酸化，磷酸化后的p38 MAPK能激活大量底物參與多種反應[22]，而未被磷酸化的p38 MAPK是沒有活性的。在肝缺血在灌注引起急性肝損傷機制探討中發現p38 MAPK信號通路活化，釋放炎癥介質，加重肝臟組織炎癥損傷。而另有文獻報道，在肝臟缺血再灌注小鼠實驗模型中，p38 MAPK抑制劑SB 239063可明顯減輕肝臟炎癥反應，恢復肝臟功能。可見p38 MAPK信號通路在急性肝損傷中起到了一定致病作用。

大量實驗研究表明p38 MAPK信號通路與急性肝衰竭發生密切相關。陳婧等[23]利用急性肝衰竭小鼠動物實驗和HBV相關慢加急性肝衰竭患者臨床實驗研究p-p38 MAPK在肝臟組織中的表達及意義時發現，動物實驗中用蛋白免疫印跡法檢測p-p38 MAPK表達實驗組高于對照組，免疫組化示隨著肝臟炎癥程度加重p-p38 MAPK表達加重；臨床試驗中示隨著病變程度加重p-p38 MAPK表達增加，這些研究結果均提示p38 MAPK信號通路在肝衰竭病變過程中發揮著重要作用。Deng等[24]用LPS/雷尼替丁(RAN)誘導大鼠特異性肝損害模型，發現LPS/RAN可顯著激活p38 MAPK，p38 MAPK抑制劑SB239063 能減少血漿中TNF-α含量，降低中性粒細胞和凝血系統的激活，從而減輕LPS/RAN誘導的肝損害，提示了p38 MAPK是肝損害發生的可能機制。但是有些研究表明p38 MAPK信號蛋白并沒有參與急性肝衰竭的發生機制。焦明靜[25]在研究過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)對D-GaLN/LPS誘導的急性肝衰竭小鼠保護機制時利用Western-bolting 檢測Wy14643(PPARα激動劑)組肝組織中磷酸化的ERK、JNK和p38 MAPK蛋白表達發現，p-ERK和p-JNK蛋白表達下調，而p-p38 MAPK蛋白表達卻無明顯變化，表明PPARα活化后可通過ERK和JNK信號通路而不是p38 MAPK信號通路抑制肝臟炎癥反應。

六、ERK、JNK和p38 MAPK信號通路相互聯合與急性肝衰竭

國內外大量動物實驗研究發現急性肝衰竭的發生不只與單一MAPK信號通路有關，可能是幾種信號通路的聯合作用。Ajaz A Ganai[26]等通過灌胃方式注入染料木素對D-GalN暴發性肝衰竭Wistar大鼠模型進行保肝治療研究，發現染料木素可抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS) 和環氧合酶-2(COX-2)表達, NO和前列腺素-E2(PGE2)分泌減少, 此外其還可抑制TNF-α和IL-1β等促炎因子的表達。這些抑制作用產生與核因子-κB(NF-κB) 活化，IKKα/β和MAPK磷酸化作用被染料木素抑制有關，提示了染料木素通過調節NF-κB和MAPK的表達維持正常的氧化還原電位和抗氧化防御機制，從而減弱D-GalN在暴發性肝衰竭Wistar大鼠的損傷作用。Wang等[27]發現在GaIN聯合LPS誘導建立的急性肝衰竭大鼠模型中L.casei Zhang(益生菌)通過調節TLR-MAPK-PPAR-γ信號通路和腸道菌群可以減少促炎因子的含量以及減輕肝細胞炎癥其主要機制是L.casei Zhang抑制了ERK、JNK和p38 MAPK磷酸化作用和增加了TLR2、TLR9和PPAR-γ的表達。Ma等[28]通過給實驗組和對照組小鼠分別注射槲皮素聯合四氯化碳或單獨四氯化碳1周后，發現槲皮素可以減輕四氯化碳引起的肝損傷，其機制之一為槲皮素可以抑制MAPK磷酸化，繼而降低NF-κB活化和炎癥因子釋放對肝臟組織損傷。

七、其他因素與急性肝衰竭

目前研究發現有眾多因素可引起急性肝衰竭。最近研究表明，細胞內信號分子糖原合成酶激酶-3(GSK3)在GaIN聯合LPS誘導的急性肝衰竭中表達上調，而其活性受到抑制可顯著改善肝臟損傷，提示了GSK3在急性肝衰竭發病過程中起到了重要作用[29-31]。趨化因子及受體參與各種細胞的吸附和保護，如趨化因子受體7(CXCR7)參與免疫反應、淋巴歸巢，具有保護細胞、抗凋亡等作用[32]。洪巧等[33]在研究CXCR7在GaIN聯合LPS誘導的急性肝衰竭SD大鼠肝組織中的表達及意義時發現，CXCR7mRNA在正常肝組織中少量表達，而其在ALF組觀察到隨著肝衰竭的進展呈先升高后下降的表達趨勢，于12 h時升至峰值，實驗結果提示CXCR7在可能肝衰竭發展的初期促進肝細胞死亡，后期則以保護肝細胞為主，但CXCR7在肝衰竭過程中是否明確可以減輕肝組織損傷還有待進一步研究。Toll樣受體(TLR)是天然免疫系統中非常重要的一類模式識別受體，TLR3是其中常見的一種，它大量分布于樹突狀細胞，能夠識別病毒及其復制中間產物，被激活后促進核因子-κB (NF-κB)和干擾素調節因子3(IRF3)入核，繼而分泌大量的促炎性細胞因子。李寧等[34]在研究慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周血單核細胞衍生的樹突狀細胞(MoDC)上TLR3觸發后細胞因子的分泌情況的臨床實驗時發現，經聚肌胞苷酸(polyI：C)刺激后，ACLF組患者NF-KB mRNA顯著高于慢性乙型肝炎組和正常對照組，而其IRF3 mRNA低于慢性乙型肝炎組和正常對照組，結果說明TLR3信號轉導通路受損，促炎性細胞因子分泌異常，可能是肝細胞免疫功能嚴重受損而致肝衰竭發生的原因之一。

綜上所述，MAPK信號通路在急性肝衰竭發生機制中有著重要作用，涉及機體內眾多炎癥因子釋放及信號蛋白表達參與的病理過程。在急性肝衰竭中深入研究MAPK及上下游信號轉導通路，可以延緩、甚至阻斷病程進展，減輕炎癥反應和減少肝細胞壞死，為治療贏得更多時間。而且可以為尋找有效可行的MAPK信號通路抑制劑提供一定的理論依據。

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(本文編輯：張苗)

全軍醫藥衛生科研計劃項目(項目編號：CLZ14JB01)

730050 甘肅 蘭州大學第二臨床醫學院 (王蓋昊)；蘭州軍區蘭州總醫院消化科(于曉輝)

于曉輝，Email：yuxiaohui528@126.com

2016-06-22)