腸結核實驗室檢查的臨床應用進展*

梅　玫 綜述，羅　雁，劉會領 審校

(天津市海河醫院　300350)

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腸結核實驗室檢查的臨床應用進展*

梅玫 綜述，羅雁，劉會領 審校

(天津市海河醫院300350)

腸結核；實驗室檢查；臨床應用

隨著人類免疫缺陷病病毒感染和免疫抑制劑的使用，結核感染的范圍日趨擴大，腸結核(ITB)也日趨頻繁，ITB是重要的肺外結核病之一，占結核病的1%～3%[1]。它是由結核分枝桿菌侵襲腸道引起的慢性特異性感染，主要影響回腸和結腸，回腸末端病變最為常見，導致胃腸道癥狀如腹痛、腹瀉、便秘等臨床表現。ITB的診斷依據為腸道病變組織中發現結核分枝桿菌、典型的干酪樣壞死表現及抗結核治療有效。由于內鏡下取材的局限性及患者合并免疫性疾病的原因，組織病理表現不典型，試驗性抗結核治療耗時較長，臨床上ITB的診斷仍依賴于病原學及實驗室檢查。本文對ITB的實驗室檢查進展綜述如下。

1　病原學檢查

1.1常規細菌學診斷方法：抗酸染色及結核桿菌培養結核桿菌涂片是指對黏膜組織進行研磨處理成液體標本，涂在新載玻片上，參照《全國臨床檢驗操作規程》對涂片進行抗酸染色，顯微鏡下觀察。研究報道ITB中抗酸染色陽性率低，程潔等[2]對67例腸結核患者進行腸鏡檢查發現結核桿菌9例，陽性率為13.4%，為了提高涂片的陽性率，臨床上出現了一些改良涂片方法，如夾層杯法、沉淀集菌法、改良萋-納染色法。王鼎鑫等[3]對16例ITB活檢組織進行改良萋-納染色法，12例找到結核分枝桿菌，該方法簡單易行，2～3 h出結果。抗酸染色檢查臨床中常規使用，但陽性率偏低，不同研究陽性率變異較大，且不能區分結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌，不能區分是否是具有活力的分枝桿菌。雖然特異性較高，仍有研究顯示，克隆恩腸病腸黏膜中偶有抗酸染色陽性，后經培養證實為非結核分枝桿菌，因此對結核病的診斷有一定的局限性。

結核桿菌培養是指病變腸黏膜組織液于羅氏培養基上孵育，觀察結核桿菌存活情況，可反映結核桿菌的存活能力，且可在培養的基礎上進一步做菌種鑒定和藥敏試驗。其陽性率較單純抗酸染色高，提高了對ITB的敏感性和特異性。Sekine等[4]對50例腸結核，138例非結核性腸道疾病患者進行內鏡下黏膜活檢并行結核桿菌相關檢查，腸結核組腸黏膜抗酸染色陽性率為38%，培養為50%，非腸結核組陽性率為0，但該檢查耗時較長，平均2～8周。因此結核桿菌培養在ITB快速診斷中價值受到一定限制。

1.2分子生物學診斷方法

1.2.1聚合酶鏈反應(PCR)PCR技術用于檢測標本中結核桿菌DNA的含量，采用PCR技術原理和結核桿菌特異性引物，模擬復制過程并進行體外核酸擴增，以確定患者感染結核桿菌。可使很微量的靶DNA在短時間內擴增至106倍以上，是目前檢測最靈敏的方法之一。本方法可在l d內完成，具有快速、高效、特異性強、敏感性高的優點。Epstein等[5]報道該技術在活檢組織檢測敏感性為22%～75%，假陽性率為0%～5%,甘華田等[6]報道，PCR檢測腸黏膜組織結核桿菌DNA陽性率為71.4%。局限性在于只能定性檢測，無法提示標本中結核桿菌的具體水平且不能進行藥物敏感試驗，而且對標本質量、實驗室的設備、環境要求較高，若臨床操作不規范或設備不完善均可能造成假陽性。

實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(FQ-PCR)對結核檢測敏感性及特異性明顯提高。FQ-PCR技術融匯了PCR 技術的核酸高效擴增、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點,直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果。FQ-PCR技術使PCR擴增、熒光探針雜交及信號檢測在單一管內完成，既簡化了操作步驟，又消除了非特異性擴增和產物污染，大大減少了假陽性的出現。崔金環等[7]對233例石蠟包埋組織進行該項檢測，發現其在結核組織中的敏感性高達82.95%，遠遠高于抗酸染色及病理陽性結果，特異度為98.08%，高于單純PCR技術。顧清等[8]對36例ITB內鏡活檢標本進行FQ-PCR檢測(其中部分為蠟塊固定標本)，23例結果陽性，對ITB診斷的敏感性為63.89%,特異性83.33%。FQ-PCR檢測TB-DNA是1種快速有效的ITB診斷方法,其定量范圍廣,檢測敏感性高。對活檢組織少、病理改變不典型、抗酸染色陰性組織的診斷和鑒別診斷尤有意義，適用于腸結核的早期診治。

1.2.2Xpert MTB/RIF檢測近年出現1種新型分子生物學診斷方法Xpert MTB/RIF檢測，它是以半巢式實時熒光定量PCR技術為基礎，以結核分枝桿菌利福平耐藥決定區rpoB基因為靶基因，設定引物、探針，并進行擴增檢測，整個過程只需把處理好的檢測標本放入試劑盒中，系統會自動運行并檢測標本是否含有結核分枝桿菌及對利福平耐藥與否[9]。Xpert MTB/RIF試驗診斷肺結核的敏感性和特異性分別為90%和98%，可較好篩查和排除肺結核，敏感性與結核桿菌快速培養基本一致，且大大縮短診斷時間，因此應用廣泛[10]。

肺外結核中，多項研究顯示有較高的臨床價值，有學者對761例肺外結核(其中48例為ITB，取病變腸黏膜組織為標本)分析發現，Xpert MTB/RIF診斷肺外結核敏感性高達90.68%，特異性99.62%[11]。賈留群等[12]對8篇有關Xpert MTB/RIF試驗在肺外結核診斷中應用的研究進行Meta分析，結果顯示其對肺外結核匯總的敏感性為0.78(95%CI：0.75～0.81)、特異性為0.99(95%CI：0.99～1.00)。通過亞組分析發現其在診斷不同器官的肺外結核中具有不同診斷價值，且差異較大，這可能與肺外結核病患者的不同部位標本中包含結核菌數量不同有關。考慮到不同的體液標本或者組織標本在Xpert MTB/RIF試驗中陽性率有所差異，Xpert MTB/RIF試驗的診斷價值可根據不同類型的肺外結核病或者不同的標本做進一步的研究，有關Xpert MTB/RIF試驗在ITB中應用的研究報道較少，特別是腸黏膜病變組織中的檢測。國內未見腸黏膜組織行Xpert MTB/RIF檢查的相關報道。目前ITB病原學診斷還沒有理想的檢測方法，可以將Xpert MTB/RIF檢查應用于ITB的診斷，并作進一步臨床觀察。

Xpert MTB/RIF試驗除了用于結核桿菌的感染還可以檢測結核桿菌對利福平耐藥情況。張治國等[10]研究顯示，以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥的敏感性和特異性分別為89．1%、96．3%，楊蘊華等[13]對1 128例結核患者研究發現以傳統藥敏方法為標準,Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性的敏感性89.5%，特異性為97.6%，Xpert MTB/RIF檢測可以很好地診斷初診患者是否對利福平耐藥，對抗結核治療提供參考，理論上對腸結核的早期診治有一定的輔助作用，但還需要進一步大樣本研究。

2　免疫學診斷方法

2.1結核抗體(TB-Ab)的檢測結核病是1種以細胞免疫為主的疾病，阿拉伯甘露聚糖(LAM)是結核桿菌細胞壁的主要組成成分之一，具有較強的免疫原性，特異性較強，可作為結核病抗體檢測的特異性抗原。臨床中檢測結核分枝桿菌特異性膜蛋白抗體(TB-Ab)作為診斷結核的1個特異性的病因學檢測指標，在結核病的診斷中具有一定的臨床價值。其陽性率相對較高，在未對樣本進行選擇的情況下陽性率仍高達52.45%[14]。文獻顯示，結核患者血清結核抗體敏感性為71.5%，特異性為90.5%，其不僅在血清中存在，在病變的胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液中陽性率更高，特異性更強，是肺外結核診斷的重要輔助指標[15]。

本方法簡單快捷，對結核病診斷和鑒別診斷起到重要輔助作用。但在免疫功能低下患者中，或處于臨床感染初期，即處于感染窗口期患者中可能出現假陰性情況，人自然感染結核后存在一定水平抗體，打過卡介苗或得過結核現已經鈣化的患者中仍可檢測到陽性結果，故存在假陽性情況，不能對結核活動做出判斷，故臨床上多與其他檢測結果聯合使用。

2.2腺苷脫氨酶(ADA)檢測ADA是1種核酸分解的代謝酶類，可特異性催化腺嘌呤核苷產生不可逆脫氨反應，參與前T細胞分化為淋巴細胞的過程，與淋巴細胞激活與分化有關，故肺外結核時，相應部位的積液中ADA含量更高。研究顯示，結核性胸腔積液進行ADA檢測，其敏感性為88.7%，特異性為93.3%，準確性為90.2%。重癥肺結核患者血清ADA活性升高，但血液病、肝硬化、SLE、糖尿病腎病，ADA的活性也升高[16]。且試驗易受溶血等因素的影響，其特異性不強。但胸腔積液、腹腔積液等的ADA檢測可作為結核性胸膜炎等肺外結核病的輔助診斷指標之一[17]。因為檢測血、積液中的結核菌抗體、ADA的生化指標簡單、經濟、快速，一些研究顯示將這些指標進行計算、聯合能提高疾病診斷的敏感性及特異性。

2.3T-SPOT試驗T-SPOT試驗是用ELISA從單細胞水平檢測細胞因子的1種細胞免疫學技術。研究發現，結核桿菌中產生RD1編碼的培養濾過蛋白10(CFP-10)及早期分泌的抗原靶點6(ESAT-6)兩種蛋白多肽，為結核菌所特有。T-SPOT中，結核感染者外周血T淋巴細胞被ESAT-6和CFP-10兩種優化的結核分枝桿菌特異性抗原活化后分泌IFN-γ，后者與微孔板上IFN-γ抗體結合，顯色形成色素沉淀斑點，從而診斷結核感染[18]。健康者及非結核感染者外周血T淋巴細胞不會產生IFN-γ，理論上而言T-SPOT對結核感染應具有一定的特異性，在腸結核的診斷及鑒別診斷中有重要作用。1篇包括12項研究的Meta分析顯示，T-SPOT鑒別CD、ITB總的敏感性和特異性分別為82.8%(95%CI，78.4%～86.6%)和86.7%(95%CI，83.2%～89.6%)[19]。雷少妮等[20]研究顯示，T-SPOT檢測ITB時敏感性及特異性分別為85.7%(12/14)和93.3%(14/15)，有助于與腸道Crohn病相鑒別。總之，T-SPOT試驗可提高結核感染診斷效率，尤其適合腸結核的快速診斷及鑒別診斷。

綜上所述，目前各項診斷技術在腸結核的診斷中都有其臨床價值，單一的檢查項目影響因素較多，已有相關研究將以上多項指標聯合起來，甚至做成預測模型用于腸結核的診斷，提高疾病的診斷率[21]。由于腸結核診斷困難，快速而準確的診斷疾病是實驗室發展的迫切需求，新的診斷技術的出現是急需的。本文中總結的結核診斷相關技術有些在腸結核的診斷中應用觀察較少，有些研究納入病例數較少，臨床中缺少大規模多中心隨機對照研究，因此各項檢查在腸結核診治中的詳細作用仍需進一步觀察總結。

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