MF59佐劑的研究進展

李卓凡 綜述，李衛東 審校

(中國醫學科學院/北京協和醫學院/醫學生物學研究所，昆明 650118)

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·綜述·

MF59佐劑的研究進展

李卓凡 綜述，李衛東△審校

(中國醫學科學院/北京協和醫學院/醫學生物學研究所，昆明 650118)

MF59；佐劑；作用機制

MF59佐劑的研究始于20世紀80年代末期。在當時重組DNA背景下，許多新的蛋白質抗原都可以用于疫苗制備。Chiron疫苗公司研制的HBV重組疫苗的成功尤其推動了這種微生物加鋁佐劑的疫苗模式[1]。但HBV是1種特殊的，可以自發形成高免疫原性病毒樣顆粒的抗原，而其他大多數重組抗原均是可溶解的單體，并且在和鋁佐劑結合后只有很弱的免疫原性。這些抗原需要比鋁佐劑效力更強的佐劑來獲得保護性的免疫力，如弗氏佐劑。因此，研制1種既能提高抗原的免疫原性，又可以避免像弗氏佐劑一樣的反應原性佐劑就成了問題的關鍵。而20多年后，MF59成為第2個成功上市的佐劑，說明了這一工作的成功。

1　MF59

1.1乳劑作為佐劑將乳劑用于佐劑已有很長的歷史。Freund等[2]在70多年前證明了礦物油(石蠟)與結核分枝桿菌結合具有佐劑的作用，即弗氏完全佐劑。而之后油包水(w/o)不含細菌成分的乳劑(弗氏不完全佐劑)被用于獸用疫苗。盡管弗氏不完全佐劑也曾被用于人用疫苗(如流感疫苗)，但其反應原性限制了廣泛的使用。乳佐劑的早期應用為MF59的研制提供了一定的思路，即油相需要生物可降解，表面活性劑需具有可安全應用的歷史背景。水包油(o/w)乳劑可將油相比例降低，從而顯著增加人體對佐劑的耐受性，同時也可降低佐劑的黏度。因此，在20世紀80年代末，o/w乳劑作為佐劑開始被應用于免疫增強劑[3-4]。

1.2表面活性劑藥物乳劑是1種內部不穩定的分散體，需要加入表面活性劑降低界面張力，防止液滴凝結。表面活性劑通常含有疏水性和親水性2種組分，定位于界面上。盡管帶電的表面活性劑是乳劑穩定劑的最佳選擇，但非離子性表面活性劑因其低毒性和對添加劑的低敏感性而更廣泛地使用。表面活性劑根據其親水性與疏水性的比例(HLB、1～20)，可以定義其相對的水相或油相的親和力。聚山梨醇酯(Tween)是HLB在9～16的表面活性劑，而失水山梨醇酯(Span)HLB為2～9。HLB值高與低的表面活性劑的組合是常用的乳劑穩定劑。因此，表面活性劑的選擇是MF59研制的重要步驟，使其成為微小的、穩定的液滴，能夠被過濾除菌[5]。

1.3角鯊烯MF59中的油相組分是角鯊烯，是1種自然生成的三萜烯烴，組分單一(C30H50)但結構復雜，在許多植物、動物以及人體中都有分布。角鯊烯是生物合成人體甾類激素途徑的中間物，是合成膽固醇的前體物質。角鯊烯在人體肝臟中合成(>1 g/d)并通過血流循環，在皮膚分布最多，是皮脂分泌物的主要組分。同時，在脂肪組織、肌肉和淋巴結中，大量的角鯊烯在自然情況下均有分布。因此，角鯊烯是兼具生物可降解性和生物兼容性的組分，也是人類飲食的1種正常組分，人類正常攝入50～200 mg/d。

1.4MF59的生產MF59基本生產步驟是將Span85分散在含有角鯊烯和Tween80的緩沖液中，之后高速攪拌至乳狀。之后，將乳劑反復用微射流機流射以形成o/w乳劑的微粒(160 nm)，再過濾除菌。MF59乳劑制備后可保持穩定性達3年以上。

2　MF59的作用機制

2.1MF59不在注射部位形成抗原庫早期用于疫苗生產的乳佐劑是w/o的形式，通常包含不可降解的油脂，可在注射部位有效地形成1個抗原庫[6]。在針對MF59的機制研究中，研究者用放射性物質(I125Ag、H3squalene)標志抗原(gD2)和角鯊烯，觀察了其在兔的肌肉注射部位的運輸情況。這些研究顯示，被標志的角鯊烯中只有10%在注射6 h后仍在注射的點上，并在120 h后降低至5%。同時，盡管在6 h后有25%的gD2抗原仍在注射點，120 h后降低至0.05%。因此，說明MF59不同于w/o形式的佐劑，并未在注射部位形成抗原庫。抗原和佐劑以不同的動力學速率被相對快速地清除[7]。

2.2MF59激發注射部位的抗原提呈上升早期有研究應用免疫熒光共聚焦的方法評估了小鼠中佐劑和抗原在注射部位附近組織的分布情況(DiI squalene、FITC gD2)[8]。肌肉注射3 h后，MF59大部分在細胞外，少量可在引流淋巴結的膜下檢測到，說明存在一定程度的胞外運輸，可能直接通過淋巴管進行。注射后48 h，MF59和抗原gD2大部分出現在注射部位的細胞內。與此同時，48 h時在引流淋巴結內也出現了MF59數量增多的情況。在T細胞附近的副皮質區域也發現了含有MF59的細胞。MF59很可能是在細胞內被運輸至淋巴結，這是MF59作用機制中最重要的1個途徑。肌肉注射后，MF59和抗原在細胞內的共定位觀察到MF59可以起到運輸系統的作用，激活附近的細胞對抗原進行提呈。注射部位含有抗原的細胞對DEC205和MHCⅡ型細胞呈陽性反應，證明這些細胞是前樹突狀細胞。關于MF59是運輸系統的假設在對分離出的人的免疫細胞進行細胞內研究時得到了證明。研究說明，MF59可以直接增強吞噬作用和胞飲作用并促進抗原提呈細胞對抗原的提呈作用。并且據推測，MF59能夠作用的主要細胞類型是單核細胞，可以被募集至佐劑作用的部位，吸收抗原并參與佐劑引起的針對樹突狀細胞表型的分化[9]。

2.3MF59召集免疫細胞到注射部位MF59注射后，通過對肌肉細胞的分離，密度梯度純化及流式細胞分析，顯示出其對于單核細胞的召集作用[10]。MF59注射后2 d，分離出的肌肉部位的單核細胞增加了7倍，之后緩慢減少。這些細胞中很大一部分是F4/80陽性的巨噬細胞，少部分是CD11c陽性的樹突狀細胞。目前的猜測是MF59的注射促進了趨化因子的分泌，從而召集了外周血中的單核細胞。1項研究顯示，CCR2 陽性小鼠中的細胞流動與CCR2-/-(無主要趨化因子受體)敲除的小鼠有顯著區別。CCR2是單核細胞趨化蛋白1～5受體(MCP-1～MCP-5)，表達于單核細胞上。因此，在CCR2 敲除的小鼠上檢測到細胞流動的增加是MF59對于細胞召集的有力說明。這項假說被另1個將MF59用作佐劑的團隊進一步印證。Hui等[11]的試驗顯示了缺乏ICAM-1分子的小鼠對鐮狀虐原蟲疫苗的中和抗體滴度遠低于正常對照組小鼠。ICAM-1在細胞黏附及血細胞外滲中起重要作用，因此這是細胞滲透的重要中介。ICAM-1依賴的免疫反應是MF59類似的乳佐劑特異性的，未在MPL類似的免疫增強佐劑中發現。

2.4MF59募集中性粒細胞和單核細胞進行抗原提呈并運輸至引流淋巴結Calabro和同事將熒光標志的佐劑和模式抗原卵清蛋白(OVA)注射至小鼠體內并用流式細胞法分析肌肉和淋巴結細胞。他們檢測到不同類型的免疫細胞在肌肉細胞中的重復波動，包括粒細胞和嗜酸性細胞等，及潛在的抗原提呈細胞，如單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。這些細胞會在2～3周內將佐劑和抗原一同運輸至引流淋巴結[12]。

2.5MF59促進抗原在淋巴結和濾泡樹突狀細胞的停留有報道，在研究MF59對疫苗抗原的促進作用時，用免疫熒光共聚焦的方法研究了抗原向小鼠淋巴結的運輸情況。他們在小鼠免疫后1、6 h和7 d時取引流淋巴結觀測。1 h 后，抗原就可在淋巴結的被膜下竇和髓室被檢測到，至二免后，抗原全部保存在濾泡樹突狀細胞。同時，也檢測到生發中心B淋巴細胞對抗原特異性抗體的大量分泌，而不加MF59的組別并無此現象，這說明MF59 對于抗原在淋巴節中保存并提呈起到了直接作用[13]。

3　MF59與流感疫苗的結合

從1990年開始，許多公司致力于研究新型的疫苗佐劑，類型包括乳佐劑、免疫刺激復合物、脂質體和微粒[14]。Syntex公司研制的o/w 乳佐劑包含角鯊烯和1種化學合成的免疫增強劑，N-乙酰胞壁酸-L-蘇氨酸-D谷氨酰胺。N-乙酰胞壁酸-L-蘇氨酸-D谷氨酰胺是MDP的衍生物，是分枝桿菌細胞壁中最有效的佐劑成分。但該佐劑的反應原性太強被放棄。之后Chiron 疫苗公司用角鯊烯和1種化學合成的MDP(胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺，MDP-PE)做流感疫苗佐劑(MF59)，也因反應原性被放棄。但根據其臨床前及臨床研究，MDP-PE并不是MF59 作為流感疫苗佐劑所必須的成分[15-16]。因此，MF59的成分確定為角鯊烯1種組分，并只針對1種目標人群是老年人的流感疫苗。

自MF59 1997年批準上市，大量的臨床研究和上市后的監控研究均證明了MF59的安全性和可靠性，在應對2009年H1N1流感大流行時，也證明了其廣泛使用時的可靠性。最近，在連續3個流感流行季節展開的大規模(>170 000 例)具有前瞻性的觀察項目后，添加MF59 佐劑的流感疫苗將65歲以上因為流感和肺炎而入院的老人的數量降低了23%[17]。

但目前在美國，有許多伊拉克退伍士兵在退伍之后患有“海灣戰爭綜合征”的情況被與其曾接種含有角鯊烯的流感疫苗的經歷聯系起來，引起了一些質疑。而關于佐劑中的角鯊烯是否能夠引起角鯊烯特異性的抗體，目前還存在爭議[18]。

4　MF59和其他疫苗的研究進展

除了在流感疫苗上的成功使用，MF59在其他疫苗的臨床前研究中也表現出了免疫增強的作用。許多臨床研究的疫苗都已經有加入MF59 佐劑之后的評價研究，如HIV、CMV、HSV、HBV、HCV等。

MF59在單純皰疹病毒疫苗(HSV-2)的3期保護效力試驗被評價為無法提供持續的保護效力。在之前的研究中，HSV-2同樣沒有顯示出治療性疫苗的保護效力，但錯誤的要求交叉保護性才是失敗的關鍵[19]。1個加入MF59佐劑的疫苗進入臨床研究的原因是其能夠引起高滴度的中和抗體和效應T細胞的反應。如果能夠以這種簡單的標準來評價疫苗，就能夠達到疫苗研制的初衷[20]。但高滴度的中和抗體無法提供對HSV-2感染的保護，且性傳播疾病通常暴露在高病毒載量環境下。

5　結　　語

MF59能夠成為繼鋁佐劑之后第2個成功上市的佐劑，與研發者獨特的眼光密不可分，也有從之前的佐劑研發失敗的經歷中獲得的寶貴經驗，也有一定的運氣成分——與已上市的流感疫苗的聯系促成了這一成就。研究者們在嘗試將更多的疫苗與MF59佐劑結合起來，但這一路途必然艱巨而不可知。無論如何，MF59 佐劑在其安全性方面從未失敗過，在其評價的試驗中均表現出良好的耐受性。在今后的發展中，MF59 將繼續被其他疫苗所利用，例如CMV，也會在HIV疫苗的效力試驗中作為單獨的免疫增強劑[21]。近期，MF59也將應用于流感四價疫苗中。

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1673-4130(2016)18-2596-03

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