結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑相關審評要點

劉容枝 綜述，李耀華 審校

(國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心，北京 100044)

?

·綜述·

結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑相關審評要點

劉容枝 綜述，李耀華△審校

(國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心，北京 100044)

結核分枝桿菌復合群；耐藥基因突變；企業參考品；分析性能評估

結核病是當前危及人類生命的主要殺手。據世界衛生組織估計，2012年全球約有45萬耐多藥結核病(MDR-TB)患者，17萬人死于MDR-TB，全球1/4的MDR-TB患者在中國[1-3]。鑒于全球耐藥結核病的嚴峻形式，世界衛生組織于2014年推出了《耐藥結核病規劃管理指南伙伴手冊》(下稱《手冊》)，旨在指導耐藥結核病的預防、診斷和治療[4-5]。耐藥結核病是指由耐藥結核分枝桿菌復合群引起的結核病。實驗室藥敏試驗是確診耐藥結核病的唯一方法。但是，傳統的實驗室藥敏試驗周期過長，容易延誤治療。基因型DST(結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑)采用分子生物學方法檢測結核分枝桿菌復合群基因組中與特定耐藥相關的突變，可以快速鑒定是否存在耐藥相關的突變或耐藥，一般在24 h內就可出結果，可有效彌補傳統藥敏試驗周期長的缺陷[6-8]。迄今為止，國內外已有多種結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑獲準上市。為了規范和指導此類試劑的注冊申報，下面總結了此類試劑申報中兩項重要的技術性文件(企業參考品和分析性能評估資料)的審評要點。

1　企業參考品

企業參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品[9-11]。申請人應詳細說明企業參考品中每種菌株/核酸的來源、突變類型、濃度和制備方法等信息。

1.1陽性參考品申報產品可檢測的所有突變類型均應設置不同濃度的陽性參考品。陽性參考品的突變類型應經過測序方法或已上市同類分型試劑的確認。常見突變類型(建議申請人根據權威機構的文件確定其代表性)的陽性參考品需采用菌株，其他突變類型的陽性參考品可采用結核分枝桿菌耐藥菌株基因組或突變質粒，不建議采用臨床樣本作為陽性參考品。

1.2陰性參考品可采用經確認靶序列未發生突變的結核分枝桿菌菌株等作為陰性參考品。

1.3最低檢測限參考品最低檢測限參考品應包括聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測限參考品應采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。

1.4精密度參考品精密度參考品至少應包括陰性、弱陽性和中陽性3個水平。中陽性參考品可不包括所有突變類型，以常見突變類型為主，但弱陽性參考品必須包括所有突變類型。常見突變類型的精密性參考品應采用菌株，其他突變類型可采用核酸。

2　分析性能評估資料

申請人應提交采用申報產品進行的所有分析性能評估資料，包括具體的試驗方法、試驗結果、統計分析以及接受標準等詳細資料。該類產品建議著重對以下分析性能進行研究[12-17]。

2.1陽性/陰性參考品符合率申報產品聲稱的所有突變類型的陽性參考品均應檢出陽性，陰性參考品應檢出陰性。

2.2最低檢測限建議采用95%(n≥20)的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。擴增反應終體系中的突變序列百分比和總核酸濃度2個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分比越高、所含核酸的數量越多，則突變越容易被檢出。而終體系中的這2個因素是由臨床樣本中的結核分枝桿菌復合群耐藥菌與野生菌的含量和相對比例決定的。因此，需從以下兩個方面考察申報產品的最低檢測限。

2.2.1100%耐藥比例下耐藥菌株/突變核酸的最低檢測濃度對于常見突變類型，將結核分枝桿菌耐藥菌株進行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株樣本。對于其他突變類型，可將突變質?；蚪Y核分枝桿菌耐藥菌株基因組DNA進行系列稀釋，制備不同濃度的核酸樣本。分別對各濃度樣本進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出時的濃度，即可作為可檢測的最低耐藥菌株/核酸濃度。

2.2.2不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：對于常見突變類型，將不同濃度的結核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進行混合，調整野生菌株和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度、各種耐藥比例的菌株混合液。對于其他突變類型，將不同濃度的野生質粒和突變質粒進行混合，調整野生質粒和突變質粒的比例，得到含不同核酸濃度、各種耐藥比例的核酸混合液。對各份混合液進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出時的濃度，即可作為可檢測的最低菌株/核酸濃度以及耐藥比例。

3　分析特異性

3.1野生型菌株的交叉反應采用不同濃度的結核分枝桿菌野生菌株進行驗證，結果為陰性。

3.2申報產品聲稱的全部突變類型間的交叉反應采用已知突變類型的耐藥菌株或核酸，驗證突變類型間的交叉反應，非目標突變類型的檢測結果應為陰性。

3.3核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發的其他病原體的交叉反應鑒于臨床樣本中可能同時含有結核分枝桿菌復合群、非結核分枝桿菌以及其他病原體，因此，為了證明申報產品檢出的陽性結果為結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變，而非其他分枝桿菌或病原體造成的假陽性結果，應對核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發的其他病原體進行交叉反應的驗證。用于交叉反應研究的其他分枝桿菌和病原體主要包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發分枝桿菌、次要分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、胃分枝桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。

4　干擾物質

4.1潛在干擾物質主要包括內源性物質和外源性藥物。建議使用醫學相關水平的干擾物濃度進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(最差條件)下進行評價。對于內源性物質的干擾，建議申請人選擇結核分枝桿菌復合群陰性的臨床樣本(該臨床樣本含有所有內源性干擾基質，比如：對于痰液樣本，含有粘液、血液等)作為內源性干擾樣本，采用申報產品對該臨床樣本進行檢測，結果應為陰性。用于干擾研究的外源性藥物主要包括：異煙肼、乙胺丁醇、利福平和吡嗪酰胺等。

4.2培養物樣本的干擾對于培養物樣本，干擾物質主要為適用培養基的干擾，應在最低檢測限濃度/陰性樣本條件下驗證適用培養基對檢測結果的影響，明確適用培養基是否對檢測結果產生干擾。

5　精密度

精密度的評價方法沒有統一的標準，在保證科學合理的前提下，申請人可根據產品的特征或研究習慣自行選擇。具體試驗方法可參考國內外的相關文件。申報產品的精密度評價主要包括以下內容。

5.1設立合理的精密度評價周期例如：連續檢測20 d，每天至少由2人完成不少于2次檢測，以便對批內/批間以及日內/日間等精密度進行綜合評價。

5.2陰性樣本采用靶序列未發生突變的結核分枝桿菌野生菌株進行試驗，陰性檢出率為100%(n≥20)。

5.3弱陽性樣本采用結核分枝桿菌耐藥菌株或突變核酸進行試驗，耐藥菌株或核酸濃度略高于申報產品的最低檢測限，陽性檢出率應高于95%(n≥20)，弱陽性樣本應包括申報產品聲稱的所有突變類型。常見突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。

5.4中等陽性樣本采用結核分枝桿菌耐藥菌株或突變核酸進行試驗，耐藥菌株或核酸濃度約為最低檢測限的2或3倍，陽性檢出率為100%(n≥20)，可選擇申報產品聲稱的部分突變類型進行驗證，但至少應包括1株結核分枝桿菌耐藥菌株。

6　不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能要求

該類產品所用臨床樣本(如：呼吸道樣本)的基質比較復雜，臨床使用前常需進行樣本前處理，并且臨床常用的前處理方法也不止1種。如果申報產品聲稱某種適用的臨床樣本類型可采用幾種方法進行樣本前處理，申請人應提交采用聲稱的樣本前處理方法與申報產品配合進行的分析性能研究資料，試驗項目至少應包括最低檢測限。

根據法規要求，核酸提取純化試劑按照Ⅰ類體外診斷試劑進行管理，產品注冊相對容易，這促進了核酸提取純化試劑在體外診斷試劑中的應用。鑒于該類產品所用臨床樣本較為復雜，申請人常采用幾種市售的核酸提取純化試劑作為申報產品的配套試劑。如果申報產品聲稱某種臨床樣本類型可采用幾種方法進行核酸提取純化，申請人應提交采用聲稱的核酸提取純化方法與申報產品配合進行的分析性能研究資料，試驗項目至少應包括最低檢測限和精密度。

7　其他需要注意的問題

如果申報產品同時適用于幾種機型，應提交采用所有適用機型進行的全項目分析性能研究資料。如果申報產品包括多種包裝規格，申請人應說明不同包裝規格的性能是否存在差異，如存在差異，應提交不同包裝規格的全項目分析性能評估資料。

企業參考品在產品的設計開發、性能驗證和生產質控等方面具有重要的作用。在產品設計研發的初期，申請人采用已上市同類產品或其他合理方法制備企業內部參考品，然后采用企業內部參考品選擇申報產品適用的主要原材料；在產品成型之后，申請人采用企業參考品對申報產品的分析性能進行驗證；在每批產品出廠時，申請人采用企業參考品對生產的每批產品進行質量控制。分析性能評估資料對產品設計開發的結果進行驗證，主要考察申報產品的最低檢測限、精密度、特異性等技術指標。鑒于該兩部分資料在注冊申報中的重要性，希望申請人在法規框架下，依托企業自身的研發平臺和研發習慣，科學合理地制備企業參考品、進行產品性能評價。

[1]韋琪平．耐多藥結核病研究進展[J]．醫學信息，2014，27(22)：670-671．

[2]肖和平．中國耐藥結核病的流行現狀與治療對策[J]．中華結核和呼吸雜志，2010，33(7)：481-482．

[3]張玲．肺結核病的診斷和控制耐藥結核的新思維[J]．臨床薈萃，2014，29(6)：601-604．

[4]王偉，劉京銘，李傳友．WHO 2014年版《耐藥結核病規劃管理指南伙伴手冊》解讀之五(耐藥結核病實驗室檢測)[J]．中國防癆雜志，2015，37(6)：655-658．

[5]聶文娟，初乃惠．WHO 2014年版《耐藥結核病規劃管理指南伙伴手冊》系列解讀之七(耐多藥與廣泛耐藥結核病的治療)[J]．中國防癆雜志，2015，37(7)：800-802．

[6]張琳琳，楊華，肖和平．結核分枝桿菌聯合藥敏試驗的研究進展[J]．中國防癆雜志，2015，37(1)：86-89．

[7]田際云，武潔，李靜，等．熔解曲線法在結核分枝桿菌藥敏試驗質量評估中的應用[J]．中華結核和呼吸雜志，2015，38(2)：105-109．

[8]歐喜超，夏輝，李強，等．結核分枝桿菌及利福平耐藥核酸擴增檢測成本分析[J]．中國防癆雜志，2013，35(9)：723-728．

[9]董勁春．定性檢測用體外診斷試劑的企業內部參考品的設置[J]．放射免疫學雜志，2011，24(1)：50-51．

[10]毛省俠，郭準．淺談體外診斷試劑質量體系中企業參考品的管理[J]．中國醫療器械信息，2011，17(10)：46-53．

[11]谷金蓮，祁自柏，揚振，等．第5套丙型肝炎病毒抗體診斷試劑國家參考品的研制[J]．中國生物制品學雜志，2006，19(1)：68-70．

[12]譚玉華，于婷，李奕輝，等．時間分辨熒光免疫法風疹病毒IgG抗體定量測定試劑盒的研制與性能評價[J]．國際檢驗醫學雜志，2014，35(4)：472-474．

[13]徐偉文．體外診斷試劑研制常用技術指標之分析性能評估[J]．分子診斷與治療雜志，2010，2(2)：140-144．

[14]單詠梅，楊凡，萬海英．LIAISON全自動化學發光儀測定25-羥基維生素D分析性能評估[J]．國際檢驗醫學雜志，2012，33(10)：1252-1253．

[15]黃嫵姣，黃憲章，莊俊華，等．CLSI EP12-A2文件在HBeAb定性檢測性能評價中的應用[J]．檢驗醫學，2012，27(11)：900-903．

[16]Clinical and Laboratory Standards Institute.EP12-A2,User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline-Second Edition[S].USA：Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[17] Clinical and Laboratory Standards Institute.EP15-A2, User Verification of Performance for Precision and Trueness；Approved Guideline-Second Edition[S].USA：Clinical and Laboratory Standards Institute,2005.

,E-mail：liyh@cmde.org.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.036

A

1673-4130(2016)18-2598-03

2016-04-03

2016-06-11)