VitaePro抑制線粒體通路對心肌細胞缺氧損傷的保護作用

趙蓓，官功昌，劉紅梅

(陜西省人民醫院醫保辦1、心臟內科2、護理部3，陜西 西安 710068)

VitaePro抑制線粒體通路對心肌細胞缺氧損傷的保護作用

趙蓓1，官功昌2，劉紅梅3

(陜西省人民醫院醫保辦1、心臟內科2、護理部3，陜西 西安 710068)

目的 探討VitaePro對心肌細胞缺氧損傷的保護作用及其機制。方法將大鼠心肌細胞H9c2分為四組：正常對照組(H9c2)、缺氧損傷模型組(Hypoxia+H9c2)、紅花油組(Safflower oil+hypoxia+H9c2)和VitaePro組(VitaePro+hypoxia+H9c2)。MTT和流式細胞術分別檢測心肌細胞增殖和凋亡情況；Western blot檢測線粒體凋亡通路相關蛋白的表達，包括B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白X(BAX)、凋亡蛋白-3(Caspase-3)和裂解后的Caspase-3(Cleaved caspase-3)；試劑盒檢測各組心肌細胞硫代巴比妥酸反應物(TBARS)水平、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。最后，Western blot檢測心血管損傷標志蛋白的表達，包括心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)。結果缺氧損傷模型組與對照組比較，細胞增殖顯著下降，凋亡率顯著增高(4.2%～14.6%，P＜0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯降低，Bax和Cleaved caspase-3的表達顯著升高(P＜0.05)，TBARS水平和MDA含量升高(P＜0.05)，SOD活性從44.9 U/mg降低到13.2 U/mg，心血管損傷標志蛋白cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達顯著升高(P＜0.05)。VitaePro組與缺氧組相比，細胞的增殖升高(P＜0.05)，凋亡率降低到6.4%，Bcl-2的表達升高，Bax和Cleaved caspase-3的表達明顯降低(P＜0.05)，TBARS水平和MDA含量明顯降低(P＜0.05)，SOD活性增大到41.0 U/mg，cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達顯著降低(P＜0.05)。結論VitaePro可以通過抑制線粒體凋亡通路和通過抗氧化作用減輕缺氧誘導的大鼠心肌細胞損傷。

大鼠心肌細胞H9c2；VitaePro；缺氧；線粒體通路；機制

心肌組織對缺氧具有高度敏感性，與缺氧有關的心血管疾病包括心肌缺血、腦卒中和心肌梗塞等[1]。缺氧引發心肌組織大量的氧化自由基堆積，造成心肌細胞的損傷和凋亡[2-3]。目前已有一些抗氧化自由基的藥物被用于心血管疾病治療的研究中，如銀丹心腦通可通過增強抗氧化酶活性和降低丙二醛水平增加抗氧化能力，從而保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷[4]；紅景天甙也能激活Bcl-2有關的生存信號通路，抑制心肌細胞中過度的氧化壓力[5]。VitaePro是蝦青素、葉黃素和玉米黃素三種類胡蘿卜素溶解在紅花油(Safflower oil)中形成的新型抗氧化劑[6]。已有研究證實葉黃素和玉米黃素能抵抗活性氧和自由基的形成，具有強抗氧化作用[7]。蝦青素比斑蝥黃質、葉黃素、玉米黃素和β-胡蘿卜素的抗氧化力強[8]，能保護細胞免受氧化應激損傷[9]。已報道蝦青素的抗氧化作用能通過抑制線粒體信號通路阻止細胞凋亡[10]。本實驗通過建立心肌細胞缺氧模型，探究VitaePro對缺氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用及其機制，從而為心血管梗塞的防治提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細胞H9c2(2-1)購于美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)；DMEM-F12培養基、D-Hanks培養基購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自HyClone公司；山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、cTnT、MB、CK-MB、LDH和β-actin一抗以及HRP標記的兔抗山羊二抗購自Pierce公司；硫代巴比妥酸反應物(Thiobarbituric reactive substances，TBARS)檢測試劑盒購自Abnova公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Maleic dialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自德國Sigma-Aldrich公司；VitaePro購自美國NIMIX公司。

1.2 心肌細胞培養及實驗分組 大鼠心肌細胞H9c2(2-1)培養于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，置于37℃、CO2培養箱中培養。選取生長密度相似，生長狀況良好的對數期心肌細胞進行隨機分組：(1)正常細胞對照組(H9c2)：未經缺氧處理，在含5%胎牛血清的培養基中培養；（2)缺氧損傷模型組(Hypoxia+H9c2)：心肌細胞在不含血清的DMEM/F-12培養基中連續培養12 h后，用預先充入95%N2+5%CO2混合氣體30 min的無糖D-Hanks培養液替代正常培養基，在經過95%N2+5%CO2混合氣平衡的單向氣流缺氧裝置中，于37℃培養6 h；(3)紅花油組(Safflower oil+ hypoxia+H9c2)：預處理的D-Hanks培養液中添加入終濃度為0.25 mg/mL紅花油后缺氧處理6 h，作為加藥組的溶劑對照；(4)VitaePro處理組(VitaePro+hypoxia+ H9c2)：預處理的D-Hanks培養液中加入終濃度為0.25 mg/mL的VitaePro抗氧化劑混合物(蝦青素2%、葉黃素8.1%、玉米黃素1.23%溶解于紅花油中)做同樣的缺氧處理。細胞培養至48 h后半量換液，待細胞長至90%左右，按1:3的比例傳代，以后每3 d進行一次全量換液，倒置顯微鏡觀察各組細胞形態并拍照記錄。

1.3 MTT法檢測細胞增殖率 各組細胞在5% CO2于37℃培養條件下同步孵育，每組細胞設3個復孔，待細胞貼壁后給藥處理繼續培養48 h再取出各組樣本，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，棄去培養液，37℃繼續孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)裂解，振蕩15 min使結晶充分溶解，用酶標儀檢測各組細胞吸光度值A570(630 nm校準)，計算細胞增殖率，細胞增殖率=處理組A570/對照組A570× 100%。

1.4 流式細胞法檢測心肌細胞凋亡 取分組處理后的心肌細胞，用4℃預冷的PBS緩沖液將細胞洗滌兩次，加入0.25%胰酶消化，收集后迅速加入0.5 mL 1×Annexin V結合緩沖液，低速離心后棄掉上清，另加入結合緩沖液10 μL和PI 5 μL并混勻，37℃避光孵育30 min，在488 nm的激發波長和530 nm的發射波長的條件下，用流式細胞儀檢測心肌細胞H9c2的凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達 將各組心肌細胞培養皿置于冰上，PBS漂洗兩次，加入4℃預冷的RIPA細胞蛋白裂解液65 μL，低溫條件下超聲破碎得到細胞總蛋白，蛋白定量檢測采用BCA法。總蛋白經SDS-PAGE電泳后用恒流濕法轉膜。加入5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉1 h，再分別加入1:3 000稀釋的山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、cTnT、MB、CK-MB、LDH和β-actin一抗，4℃輕搖過夜；隨后加入相應的HRP-標記的兔抗山羊二抗(1：100稀釋)，37℃恒溫搖床孵育1 h。X線膠片曝光顯影，Image-Pro Plus分析結果。蛋白的相對表達量用待測蛋白與β-actin的灰度值比值計算。

1.6 氧化應激指標TBARS含量測定 每組細胞用0.01 M PBS溶解制成細胞懸液，調節細胞濃度至2× 107cells/mL。將1 mL TBA：TCA：HCl=1:1:1的溶液混勻(其中含0.37%硫代巴比土酸、15%三氯乙酸和0.25 N HCl)，沸水加熱15 min后冷卻，室溫1 000 r/min離心10 min。將一系列2～10 nm的標準溶液(甲氧基丙烷)做類似處理，上清在535 nm波長處檢測吸光值。

1.7 SOD活性測定 SOD的活性檢測按照試劑盒的說明測定。酶工作液與水溶性四氮唑鹽(WST)工作液加入每組心肌細胞中，37℃恒溫孵育20 min，于540 nm波長處測吸光值。

1.8 MDA活性測定 MDA含量用酶聯法測定，加入20%三氯乙酸(TCA)到各組細胞并孵育20 min，隨后加入0.1 mol/L鹽酸(HCl)和0.67%硫代巴比妥酸(TBA)于95℃水浴1 h。過氧化脂質降解產物中的MDA能縮合TBA，生成紅色產物，離心后在532 nm波長處測吸光值。

1.9 統計學方法 采用SPSS15.0軟件對實驗數據進行統計學分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，實驗數據除心肌細胞形態圖為定性資料外，均為定量資料，兩組間比較采用t檢驗，校驗水準α=0.05；多組間比較，數據符合正態分布，方差齊性檢驗符合方差整齊的假設，行單因素方差分析及LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VitaePro處理抑制缺氧誘導的心肌細胞增殖率 各組細胞分別在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，由圖1A可以看出，與正常細胞對照組相比，缺氧組細胞數目明顯降低，部分細胞形態由長梭狀皺縮為三角形或片狀。紅花油組細胞數目與缺氧損傷模型組無明顯差異，VitaePro處理組細胞較缺氧組數目明顯增多。MTT實驗結果表明，與對照組相比，缺氧損傷模型組細胞增殖率明顯下降(P＜0.05)。與缺氧組比較，VitaePro處理組細胞增殖率明顯升高(P＜0.05)，紅花油組與缺氧損傷模型組細胞增殖率差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1B。

圖1 VitaePro對缺氧誘導的大鼠心肌細胞增殖的影響

2.2 VitaePro處理抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡率升高 缺氧損傷模型組與正常細胞對照組比較細胞凋亡率顯著增加，從4.2%提高到14.6%(P＜0.05)；與缺氧損傷模型組比較，VitaePro處理組處理缺氧誘導的心肌細胞凋亡受到明顯抑制，凋亡率降低至6.4% (P＜0.05)，且VitaePro處理組與正常細胞對照組細胞凋亡率差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

圖2 VitaePro對缺氧誘導的大鼠心肌細胞凋亡的影響

2.3 VitaePro抑制缺氧誘導的心肌細胞線粒體凋亡信號通路中Bax表達升高，Bcl-2表達降低和凋亡標志蛋白Cleaved caspase-3的表達升高 為進一步研究VitaePro抑制缺氧誘導心肌細胞凋亡的機制，通過Western Blot檢測各組細胞中線粒體凋亡信號通路標志蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved caspase-3的表達。與正常細胞對照組相比，缺氧損傷模型組中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達顯著升高，分別升高5.0倍和6.2倍(P＜0.05)，Bcl-2的表達顯著降低11.0倍 (P＜0.05)，caspase-3的表達無明顯變化；VitaePro處理組與缺氧損傷模型組相比，Bax和Cleaved caspase-3的蛋白表達水平分別降低2.1和2.4倍(P＜0.05)，Bcl-2水平顯著升高，提高5.5倍(P＜0.05)，且VitaePro處理組與正常細胞對照組各通路蛋白的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖3。

2.4 VitaePro抑制缺氧誘導的受損心肌細胞氧化應激指標TBARS升高，MDA水平升高，SOD水平降低 與正常細胞對照組比較，缺氧損傷模型組TBARS和MDA含量顯著增加(P＜0.05)，SOD活性明顯降低(P＜0.05)，TBARS水平從23.1 mmol/mg升高到74.2 mmol/mg，MDA含量從0.84 mmol/mg提高到2.9 mmol/mg，SOD活性從44.9 U/mg降低到13.2 U/mg。VitaePro處理可抑制缺氧引起的TBARS和MDA含量的增加(P＜0.05)，并顯著提高SOD的活性(P＜0.05)，TBARS水平降低到31.2 mmol/mg，MDA含量降低到1.22 mmol/mg，SOD活性增大到41.0 U/mg，見圖4。

2.5 VitaePro抑制缺氧誘導的心肌損傷標志蛋白的表達升高 Western blot檢測心肌損傷標志蛋白cTnT、Mb、CK-MB和LDH的表達，結果表明，與正常細胞對照組比較，這四種標志蛋白的表達在缺氧組中顯著升高(P＜0.05)，分別提高了15.2、8.5、1.7和9.2倍，VitaePro處理組與缺氧損傷模型組相比明顯降低(P＜0.05)，分別降低5.4、3.2、2.0和3.6倍，且VitaePro處理組與正常細胞對照組的蛋白表達差異無統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 各組心肌細胞中Bax，Bcl,Caspase-3和Cleaved caspase-3的表達水平

圖4 VitaePro對缺氧誘導心肌細胞TBARS與MDA含量以及SOD活性的影響

圖5 VitaePro對心肌損傷標志蛋白表達水平的影響

3 討 論

缺氧一直是心血管領域的研究熱點之一。研究表明，氧自由基增多是缺氧誘導心肌細胞凋亡的重要因素，它們能直接損傷生物大分子，造成線粒體DNA (mtDNA)突變，引發線粒體代謝功能障礙[11]，從而導致抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax蛋白表達升高，并且激活Caspases凋亡蛋白引起心肌細胞凋亡[12]。因此能抵抗氧自由基增多，調節凋亡相關因子表達的抗氧化物質在抑制缺氧引起的細胞損傷中具有重要作用。VitaePro是一種新型抗氧化物質，由蝦青素、葉黃素和玉米黃素三種抗氧化物質組成，其中蝦青素已被證實能通過抗氧化作用降低四氧嘧啶誘導的糖尿病鼠淋巴球細胞質中Ca2+水平，減少超氧陰離子、一氧化氮和過氧化氫的含量，從而抑制細胞凋亡[13]。本研究首先通過MTT和流式細胞術檢測心肌細胞的增殖和凋亡，發現與缺氧心肌細胞相比，經VitaePro處理的細胞增殖率顯著提高，凋亡降低。推測VitaePro能抑制缺氧引起的心肌細胞損傷。

線粒體凋亡通路是心肌細胞凋亡的標志性通路之一，主要包括Bcl-2家族的激活，細胞色素C(Cytc)的釋放以及Caspase級聯反應[14-15]。缺氧致使心肌細胞受損后，凋亡信號因子Bax可能改變線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道(VDAC)構象，開放線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)，使細胞凋亡因子釋放到胞漿[16]，Bax也可能發生多聚化，形成膜通道口，使Cytc從線粒體釋放到胞漿，從而導致細胞凋亡升高[17]。當缺氧使心肌細胞中凋亡因子作用于線粒體時，Bcl-2可與線粒體外膜的VDAC結合，關閉MPTP，抑制Bax在線粒體的定位和寡聚化，抵抗Cytc誘導的Caspase級聯激活，從而抑制細胞凋亡[18]。研究表明蝦青素能阻止促凋亡蛋白Bax和Bad的易位，影響Bcl蛋白從線粒體轉移到胞質中，從而抑制細胞凋亡[10]。本研究結果表明，缺氧心肌細胞經VitaePro處理能下調Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達，并上調Bcl-2蛋白的表達。證明VitaePro可以抑制缺氧心肌細胞中的線粒體凋亡通路，與Shen等[19]報道一致。

TBARS、MDA和SOD等氧化指標常用來反映機體氧化應激水平[20]。很多抗氧化劑已被證實能降低細胞中氧化應激水平，促進細胞存活[21-22]。研究表明，類胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃素是具有強抗氧化力的單藥[23]。本研究結果發現，缺氧心肌細胞經VitaePro處理能降低細胞中的TBARS與MDA的含量，并顯著提高SOD的活性。表明VitaePro的抗氧化作用可以顯著降低缺氧引起的心肌細胞氧化應激，從而保護心肌細胞。

綜上所述，我們的實驗結果證實了缺氧會引起心肌細胞的損傷，但VitaePro可通過抑制心肌細胞內的線粒體凋亡通路，降低細胞內的氧化應激水平，從而促進心肌細胞的增殖并減少細胞凋亡。說明VitaePro對缺氧引起的心肌細胞損傷有明顯的對抗和保護作用。由于時間有限，本實驗僅在體外建立心肌缺氧損傷模型，進一步研究計劃建立心肌缺氧損傷的動物模型，探究VitaePro在體內實驗中對心肌細胞的保護作用。

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Protective effects of VitaePro inhibiting the mitochondrial pathways on hypoxia-induced cardiomyocytes injury.

ZHAO Bei1,GUAN Gong-chang2,LIU Hong-mei3.Department of Medical insurance1,Department of Cardiology2, Department of Nursing3,Shaanxi Provincial People's Hospital,Xi'an 710068,Shaanxi,CHINA

Objective To study the protective effect and mechanism of VitaePro on hypoxia-induced cardiomyocytes injury.MethodsRat myocardial cells H9c2 were randomly divided into four groups:H9c2 group(the control group),Hypoxia+H9c2 group,Safflower oil+hypoxia+H9c2 group and VitaePro+hypoxia+H9c2 group.Cell proliferation and cell apoptosis were detected by MTT and flow cytometry,respectively.The expression levels of mitochondrial apoptotic pathway related proteins were measured by Western blot,including B cell lymphoma 2(Bcl-2),Bcl-2-associated X(Bax),Caspase-3 and Cleaved caspase-3.The thiobarbituric acid reactive substance(TBARS)level,malondialdehyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity were measured by corresponding kits.Finally,the expression of cardiovascular injury markers protein were measured by Western blot,including cardiac troponin T(cTnT),myohemoglobin(Mb),creatine kinase isozyme MB(CK-MB)and lactic dehydrogenase(LDH).ResultsCompared with control group,the cell proliferation in Hypoxia+H9c2 group was significantly decreased(P＜0.05),and the cell apoptosis was significantly increased(4.2%～14.6%,P＜0.05).The expression level of Bcl-2 was significantly decreased,while Bax and Cleaved caspase-3 were significantly increased(P＜0.05).The level of TBARS and the content of MDAwere increased,and the activity of SOD was decreased from 44.9 U/mg to 13.2 U/mg.The expressions of cardiovascular injury markers cTnT,Mb,CK-MB and LDH were significantly increased(P＜0.05).Compared with Hypoxia+H9c2 group,the cell proliferation in VitaePro+hypoxia+H9c2 group was increased(P＜0.05),and the cell apoptosis was decreased to 6.4%.The expression level of Bcl-2 was increased,while Bax and Cleaved caspase-3 were significantly decreased(P＜0.05).The level of TBARS and the content of MDA was significantly decreased(P＜0.05),and the activity of SOD was increased to 41.0 U/mg.The expressions of cardiovascular injury markers cTnT,Mb,CK-MB and LDH were significantly decreased(P＜0.05).ConclusionVitaePro can reduce hypoxia-induced myocardial cell injury in rats via inhibiting mitochondrial apoptosis pathway and through antioxidant effect.

Rat myocardial cells H9c2;VitaePro;Hypoxia;Mitochondrial pathways;Mechanism

R-332

A

1003—6350（2016）12—1900—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.003

2015-12-31)

官功昌。E-mail：huiqingguohn@163.com