糖化清蛋白的診斷優勢及其檢測現狀

尹逸叢 綜述,邱 玲 審校

(北京協和醫院檢驗科 100730)

?

·綜 述·

糖化清蛋白的診斷優勢及其檢測現狀

尹逸叢 綜述,邱 玲△審校

(北京協和醫院檢驗科 100730)

糖化清蛋白； 糖尿病； 標準化

糖尿病已經成為全球威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一。目前，糖尿病患病率、發病率和糖尿病患者數量急劇上升，根據國際糖尿病聯盟(IDF)統計，2012年全世界糖尿病患者人數已經達到3.71億[1]。近30年來，隨著我國經濟的高速發展、生活方式西方化和人口老齡化，肥胖率上升，糖尿病患病率也呈快速增長趨勢；2010年全國31省市18歲以上9萬余人口的糖尿病調查顯示成年人糖尿病患病率達9.65%[2]。2013年，中國研究人員在《美國醫學會雜志》(JAMA)發表報告[3]，其調查顯示中國已成為糖尿病人口大國，成人糖尿病患者數量估計超過1億，可能已達“警戒級別”。

糖尿病人群不斷增多，對中國社會與公共衛生構成挑戰，給社會經濟帶來了沉重的負擔，是嚴重威脅人類健康的世界性公共衛生問題。糖尿病引起的長期碳水化合物及脂肪、蛋白質代謝紊亂可引起多系統損害，增加心臟病、中風、腎病、失明乃至截肢的風險[4]，降低患者生活質量，病死率高。因此，對于糖尿病的早期發現、有效防治有利于提高國人的生活質量，減輕患者及國家經濟負擔。近年來，糖化清蛋白(GA)逐漸受到研究者及臨床的重視，被用來輔助診斷貧血、妊娠、血紅蛋白(Hb)代謝異常患者體內真實血糖水平。

GA比血糖相對穩定，不受短期生活方式影響；比糖化血紅蛋白反映周期短；與糖化血清蛋白相比不受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質等影響。在診斷糖尿病方面具有十分重要的價值和優勢。因此，GA有望成為今后糖尿病監測的重要指標。本文主要闡述了GA的基本結構、在診斷糖尿病方面的優勢及其檢測現狀。

1 GA的結構

GA是葡萄糖與血漿清蛋白發生非酶糖化反應的產物，反映糖尿病患者過去2～3周的平均血糖水平。

非酶糖化反應也被稱為Maillard反應，是指蛋白質中氨基酸的N末端氨基或側鏈氨基與葡萄糖及其衍生物的醛基縮合,產生可逆的Schiff堿中間體，經Amadori反應重排后形成相對穩定的糖基化產物-果糖胺，即Amadori產物。Amadori產物降解產生的各種高度活性的羰基化合物,再與其他游離氨基基團反應,并經過一系列的化學重排和脫水反應,生成不可逆的糖基化終產物(AGEs)[5]。

血清中清蛋白濃度比較高(3.0～5.0 g/dL)，大約占血清蛋白的60%，清蛋白在調節滲透壓和pH及抗氧化方面具有十分重要的作用；它還是一種轉運蛋白，可以結合多種激素、磷脂、藥物和鐵離子。清蛋白相對分子質量為66 438，包括585個氨基酸殘基。大量的研究已經證實了清蛋白發生非酶糖基化的主要位點，其賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸由于其高度親核特性，很容易被糖基化。研究證實，Lys-525是人血清清蛋白在體內發生非酶糖基化最主要的位點，在健康人體內該位點發生非酶糖基化反應的水平占總糖基化反應的48%，在血糖水平不穩定的患者體內該位點發生非酶糖基化反應的水平占總糖基化反應的33%[6-8]。除此之外，賴氨酸的其他位點Lys-199、Lys-281、Lys-489也是賴氨酸發生糖基化的主要位點，但是其糖基化水平遠低于Lys-525，如Lys-199僅占總糖基化水平的5%[8]。由于賴氨酸糖基化位點眾多，在總糖基化水平中所占比例高，所以日本臨床化學糖尿病委員會定義GA為血清/血漿清蛋白中糖基化的賴氨酸[9]。

2 GA與其他血糖監測方法相比的優勢

目前對糖尿病的檢測項目主要為血糖、糖化血紅蛋白和糖化血清蛋白[10]。即刻血糖的檢測容易受到藥物、飲食、情緒等因素的影響，其檢測結果只能代表采樣當時的血糖情況，對診斷糖尿病尤其是治療過程中監測患者的病情有很大的局限性。而且，空腹血糖要求個體空腹8 h，對于早餐后或下午就診的患者可操作性差。雖然口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)也可以用來診斷糖尿病，但是OGTT實驗過程繁瑣，耗時，變異性大，故臨床使用率低。

糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)是HbA的b鏈N-末端纈氨酸的氨基與葡萄糖的羧基發生非酶促反應形成不穩定的Schiff堿，進一步通過轉位、分子重排形成穩定的酮胺，即HbA1c。因紅細胞的半衰期為120 d，故HbA1c可有效地反映患者過去2～3個月內的平均血糖水平，且不受空腹及胰島素治療的影響，變異性小。Petersen等[11]發現，不同個體的空腹血糖日間變異率約12%～15%，而HbA1c僅約為1.9%。HbA1c測定更加便捷、可以在任意時間采血，其準確性、穩定性、可重復性高。目前，HbA1c是國際上監測長期血糖控制的金指標。但是HbA1c的測定結果仍然受多種因素的影響：多種血紅蛋白病，如血紅蛋白S、血紅蛋白C、血紅蛋白D、血紅蛋白E等血紅蛋白的存在會干擾HbA1c的檢測[12]；妊娠也是影響HbA1c測定結果的因素之一，Rafat等[13]發現糖尿病患者在孕期由于鐵缺乏導致HbA1c水平升高，不能真實反映血糖控制狀態，而此時GA則可反映血糖控制情況。故GA可對初診糖尿病患者和妊娠糖尿病患者的短期治療效果做出較為準確的估計，從而有助于調整臨床治療方案及判斷病情；此外，紅細胞病理性改變如溶血性貧血、腎衰竭、大量失血或輸血將導致HbA1c結果不準確[14]；飲食和藥物，如抗氧化劑(VC、VE等)能抑制血紅蛋白的糖基化，阿司匹林能使HbA1c輕微升高；尿毒癥、高膽紅素血癥、高三酰甘油血癥、阿片類藥物等都會干擾HbA1c的檢測[15]。而GA由于半衰期為19 d，可反映患者近2～3周內的血糖水平，對血糖值的變化較HbA1c更為靈敏，在反映近期內血糖的漂移變化及餐后血糖控制情況方面優于HbA1c。而且GA的檢測不受血紅蛋白病、妊娠、紅細胞壽命改變等影響。因此，測定GA對準確評價血紅蛋白代謝異常、妊娠貧血患者體內真實血糖水平具有重要意義。

糖化血清蛋白是測量血清中各種蛋白質、氨基酸的糖化值，其主要成分是GA，還包括糖化球蛋白、脂蛋白等，反映測定前2～3周血糖的平均水平；但其測定結果反映血清中總的糖化血清蛋白質(包括清蛋白與其他蛋白分子)，易受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質等的影響[16]。而GA的測定是在糖化血清蛋白的基礎上，利用GA與血清清蛋白的百分比表示GA的水平，去除了血清清蛋白水平對檢測結果的影響，故較糖化血清蛋白更精確[17-18]。

3 GA的測量方法

GA的檢測方法包括比色法、色譜分析法、免疫分析法、酶法等。

3.1 比色法 硫代巴比妥酸法(TBA)是測量酮胺的經典比色法，是基于清蛋白釋放的5-羥甲基糠醛(HMF)可以和硫代巴比妥酸發生顯色反應。氮藍四唑(NBT)是另一種對酮胺進行定量檢測的比色法，NBT和酮胺釋放的甲瓚發生還原反應，通過測定吸光度來對酮胺進行定量檢測。然而這兩種比色法都存在缺陷，且特異性不高。TBA法中形成的HMF具有熱不穩定性，游離的葡萄糖也會干擾此反應；NBT法容易受到巰基、尿酸、脂血的干擾[19]；苯胺加合物定量方法通過果糖胺和苯肼反應來對GA定量，但是這種方法并未應用于臨床實驗室。

3.2 色譜分析法 色譜分析法是對GA進行定量測定的一種方法，色譜分析法不受清蛋白濃度的影響。高效液相色譜法(HPLC)可以對GA中的糖基化的氨基酸進行定量檢測，該法通過陰離子交換色譜柱提取純度較高的清蛋白，再經親和層析法分離糖化的清蛋白和非糖化的清蛋白[20]。清蛋白中的果糖胺產物經過水解和脫水，生成糠氨酸，液相色譜法可以直接對糠氨酸進行定量檢測，和比色法相比該法的特異性更高。但是HPLC法的檢測速度為12例標本/小時，無法滿足大量的臨床標本檢測[21]。

3.3 免疫分析法 硼酸鹽酶聯免疫吸附實驗(ELISA)其原理是酶聯的硼酸鹽可以和GA-抗人血清清蛋白抗體的復合物發生反應，但是GA的水平會受到抗體特異性的影響，應用這種方法時需要考慮抗體的化學位阻效應及硼酸鹽的特性[21]。

3.4 酶法 目前，臨床檢測廣泛應用的是酶法，酶法試劑盒使用方便。該方法應用清蛋白特異的剪切酶包括蛋白酶、酮胺氧化酶及溴甲酚紫試劑對GA進行定量檢測，是一種很敏感的方法。由于所受干擾少，酶法與比色法相比能更準確地對GA進行定量。酶法的基本原理是：首先加入酮胺氧化酶(KAOD)消除內源性糖化氨基酸，其次用清蛋白特異性的蛋白酶將GA轉變為糖化氨基酸，生成的糖化氨基酸在KAOD的作用下生成葡萄糖酮醛，氨基酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶(POD)的作用下定量地變換成有色物質，通過測定吸光度而定量從GA生成的糖化氨基酸。

但是各個廠家對血清的處理方法并不統一，經前期調研發現，有些廠家并沒有消除內源性糖化氨基酸這一步驟，還有一些廠家直接測定糖化血清蛋白的值，并以此來代替GA。而且各個廠家的酶法試劑盒在定值方面并不一致，部分廠家采用了測定清蛋白之后采用一定的公式將GA的結果轉換成GA%，而另一部分則是直接測定GA值。另外，各個廠家GA的單位也不一致，有些廠家采用g/dL、g/L，有的廠家則采用μmol/L。不同廠家酶法試劑盒間的巨大差異和參考范圍的不一致必然會導致結果間的巨大差異，導致錯誤的醫學決定，限制該項目在臨床發揮其重要作用，因此，亟須實現GA檢驗結果的準確、可比。

4 GA的標準化現狀

實現檢驗結果準確的最有效手段是建立和保證檢驗結果的溯源性。對于臨床檢驗量值溯源的簡單理解就是應用參考系統，即用參考測量程序或參考物質建立或驗證常規檢驗結果的準確性。但是GA作為大相對分子質量且成分復雜的蛋白質，其參考系統的建立一直未有突破性進展。美國的4家商業性參考實驗室曾推薦硼酸鹽親和層析法作為參考方法，但是文獻[22]稱應用親和層析法檢測GA的結果存在正常人和糖尿病患者交叉的現象，正常個體的GA值范圍為0.6%～8.6%，糖尿病患者的GA值范圍為1.4%～16.5%。并且可能受到其他的糖化分子的影響，導致檢測結果并不準確。隨著質譜(MS)技術的發展，2015年日本臨床化學學會(JSCC)將GA定義為清蛋白分子中所有的糖化賴氨酸，利用同位素稀釋質譜法(ID-MS)建立了GA測定的候選參考方法并研制了GA標準物質JCCRM611-1[23]。JSCC將GA定義為清蛋白分子中所有的糖化賴氨酸，用所有糖化賴氨酸占清蛋白的摩爾比來表示GA的量。但是該方法操作步驟復雜，對設備要求較高，并且無商品化的同位素標記GA。至今，西方國家及中國均未建立合適的參考方法及GA參考物質。然而，GA在中國臨床應用非常廣泛，但是由于標準的不統一、結果一致性差，應用較為混亂。因此，GA參考系統的建立仍有很長的路要走。

基于上述分析，GA在貧血、妊娠、血紅蛋白代謝異常等糖尿病患者的監測中發揮著重要作用。若將GA納入糖尿病的診斷標準，勢必會提高糖尿病患者的篩查、診斷、監測和治療水平。如同糖化血紅蛋白和膽固醇這兩項監測指標，GA必須在實現標準化之后才有可能被列入國際指南中[24-25]。因此，建立GA參考系統，促進GA測定方法的標準化和一致化的工作亟待提上日程。

[1]Guariguata L.By the numbers:new estimates from the IDF Diabetes Atlas Update for 2012[J].Diabetes Res Clin Pract,2012,98(3):524-525.

[2]廖涌.中國糖尿病的流行病學現狀及展望[J].重慶醫科大學學報,2015,40(7):1042-1045.

[3]Xu Y,Wang LM,Jiang H,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948-959.

[4]Furusyo N,Hayashi J.Glycated albumin and diabetes mellitus[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(12):5509-5514.

[5]Neelofar K,Ahmad J.Amadori albumin in diabetic nephropathy[J].Indian J Endocrinol Metab,2015,19(1):39-46.

[6]Ueda Y,Matsumoto H.Recent topics in chemical and clinical research on glycated albumin[J].J Diabetes Sci Technol,2015,9(2):177-182.

[7]Garlick RL,Mazer JS.The principal site of nonenzymatic glycosylation of human serum albumin in vivo[J].J Biol Chem,1983,258(10):6142-6146.

[8]Iberg N,Flückiger R,Iberg N,et al.Nonenzymatic glycosylation of albumin in vivo.Identification of multiple glycosylated sites[J].J Biol Chem,1986,261(29):13542-13545.

[9]Takei I,Hoshino T,Tominaga M,et al.Committee on Diabetes Mellitus Indices of the Japan Society of Clinical Chemistry-recommended reference measurement procedure and reference materials for glycated albumin determination[J].Ann Clin Biochem,2016,53(1):124-132.

[10] 吳弟梅.血糖、糖化清蛋白、糖化血紅蛋白的檢測方法與臨床應用[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(5):583-585.

[11]Petersen PH,Jorgensen LGM,Brandslund I,et al.Consequences Of Bias and Imprecision in Measurements of Glucose and HbA1c for the Diagnosis and Prognosis of Diabetes Mellitus[J].Scand J Clin Lab Invest Suppl,2005,240(240):51-60.

[12]Lin CN,Emery TJ,Little RR,et al.Effects of hemoglobin C,D,E,and S traits on measurements of HbA 1c,by six methods[J].Clin Chim Acta,2012,413(7/8):819-821.

[13]Rafat D,Rabbani TK,Ahmad J,et al.Influence of iron metabolism indices on HbA1c in non-diabetic pregnant women with and without iron-deficiency anemia:effect of iron supplementation.[J].Diabetes Metab Syndr,2012,6(2):102-105.

[14]Ueda Y,Matsumoto H.Recent topics in chemical and clinical research on glycated albumin[J].J Diabetes Sci Technol,2015,9(2):177-182.

[15]李婭,宋宇,段勇.糖化血紅蛋白檢測的局限性[J].中華檢驗醫學雜志,2012，35(6):501-504.

[16] 王冰,王玉明,段勇.糖化血清白蛋白分子特性及臨床意義[J].實驗與檢驗醫學,2015,33(6):693-696.

[17]Danese E,Montagnana M,Nouvenne A,et al.Advantages and pitfalls of fructosamine and glycated albumin in the diagnosis and treatment of diabetes[J].J Diabetes Sci Technol，2015，9(2):169-176.

[18]包玉倩.糖化白蛋白的臨床應用——現狀與未來[J].中華糖尿病雜志,2015,7(10):597-599.

[19]Mashiba S,Uchida K,Okuda S,et al.Measurement of glycated albumin by the nitroblue tetrazolium colorimetric method[J].Clinica Chimica Acta,1992,212(1/2):3-15.

[20]Kouzuma T,Usami T,Yamakoshi M,et al.An enzymatic method for the measurement of glycated albumin in biological samples.[J].Clin Chim Acta,2002，324(1/2):61-71.

[21]Kohzuma T,Yamamoto T,Uematsu Y,et al.Basic performance of an enzymatic method for glycated albumin and reference range determination[J].J Diabetes Sci Technol,2011，5(6):1455-1462.

[22]Roohk HV,Zaidi AR.A review of glycated albumin as an intermediate glycation index for controlling diabetes[J].J Diabetes Sci Technol,2008，2(6):1114-1121.

[23]Takei I,Hoshino T,Tominaga M,et al.Committee on Diabetes Mellitus Indices of the Japan Society of Clinical Chemistry-recommended reference measurement procedure and reference materials for glycated albumin determination[J].Ann Clin Biochem,2016,53(1):124-132.

[24]張捷.糖化血紅蛋白檢測的標準化進程及臨床應用[J].中華檢驗醫學志,2012,35(6):511-516.

[25]周波,劉秀雯,邢精紅.臨床血脂的測定與標準化研究進展[J].檢驗醫學與臨床,2011,8(3):338-340.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.027

A

1673-4130(2016)24-3456-03

2016-06-23

2016-09-29)

△通訊作者，E-mail：lingqiubj@aliyun.com。