臨床檢驗液相色譜-質譜檢驗中質量控制*

葉圓圓，王 薇，趙海建，王治國

(北京醫院衛生部臨床檢驗中心，北京 100730)

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·檢驗科與實驗室管理·

臨床檢驗液相色譜-質譜檢驗中質量控制*

葉圓圓，王 薇，趙海建，王治國△

(北京醫院衛生部臨床檢驗中心，北京 100730)

本文從液相色譜-質譜(LC-MS)檢測的質量保證和質量控制著手，討論了質控品選擇、質控濃度和頻率、LC-MS的額外質量控制樣品、質控品可接受性評價、質控失控的糾正、多組分和多重檢測的質控要求、周期性質量保證程序和其他質量保證方面，希望對LC-MS檢測的質量控制和質量保證提供參考。

液相色譜-質譜； 質量控制； 臨床檢驗

質量管理體系包括使實驗室滿足其質量目標的政策和程序。實驗室質量管理體系的兩大重要組成成分是質量保證(QA)和質量控制(QC)。液相色譜-質譜(LC-MS)檢測的QA程序必須監控從檢驗前期到結果報告和解釋的檢驗全過程。QC計劃應提供正在使用的LC-MS法的性能評價以保證進行合適的校準和保持合適的測量不確定度。定量LC-MS法可能會使用標本準備或預處理步驟如稀釋、衍生化、水解、提取、加入內標和濃縮程序。為了使QC過程能充分地監控整個檢驗測量階段，必須用與患者標本測量相同的程序來測量質控品。而且，質控品必須遵循所有的預處理步驟。

每個LC-MS法都必須定義其最低質量要求。QC要求發展時應考慮方法的用途并以允許總誤差(Tea)界限、預期生物學變異或醫療上使用該結果的風險為基礎[1-2])。已有文件提供了QA和QC的一般指導[3-6]。

1 質控品選擇

LC-MS檢測的質控品選擇應考慮以下兩點：質控品的基質成分和質控品的穩定性。

1.1 質控品的基質 LC-MS檢測的QC過程必須監控重要的性能指標如校準有效性、提取效率、柱效和離子抑制程度。這些性能參數通常取決于樣品基質的組成成分[7-8]。用與患者樣品基質不同的質控品來確定LC-MS的性能參數可能是無效的,因為待測樣品含有患者樣品基質。因此，質控品的基質成分應與患者樣品基質盡可能相同。一般情況下，商品化的質控品如果其基質合適的話是可以使用的。但對某些LC-MS檢測而言，商品化感興趣分析物是不可使用的，因為它們通常是為免疫檢測方法而設計的。而免疫檢測法通常沒有LC-MS法那么大的分析測量范圍，因此商品化質控品可能不能表示最佳質控濃度范圍。

含有內源性分析物的混合患者樣品或加入外源性分析物的混合樣品都可作為質控品。但是基質成分的存在和含量，如脂類、蛋白和藥物，可能會隨混合患者樣品的改變而改變。這些物質可能會造成干擾或增加物質間的批內或批間變異。吸附過的血清通常可用作內源性分析物的質控品準備的基質。但是，殘留的碳和吸附過程引起的基質變化可能造成該樣品基質與原始的患者樣品基質不同。對于藥物檢測，質控品應包括母體化合物和活性代謝產物。

應評估用于生產或準備質控品的程序、瓶間均勻性、批內變異和批間變異以確定該質控品是否適合于長期監控。質控品和校準品的制備應有兩套不同的基礎物質準備方案。由于對LC-MS法存在基質相關的離子抑制這種獨特的影響，因此建議對質控品基質與患者樣品的可比性進行評價。基質可比性的體現是通過展示質控品有與原始患者樣品可比的LC-MS性能參數，如提取效率、回收率、色譜特征和離子抑制[8]。實驗室必須定義性能參數可比性的可接受標準并將其文件化[9]。

1.2 質控品穩定性評估 對質控品穩定性特點的基礎評估對于使用QC值來監控方法性能是十分重要的。若質控品保存不當或降解則無法使用。如果實驗室自己制備質控品，則實驗室必須開展研究以確定其適合的保存條件和穩定性要求。

若實驗室自己確定質控品的穩定性要求，則以下信息應文件化：保存條件、測定的濃度、不同時間間隔后改變的程度和確定穩定性是否可接受的標準。若質控品有凍融循環，則應測定多次凍融循環后的影響程度。此外，應評價樣品準備和分析的時間間隔中，室溫下質控品的短期穩定性。實驗設計詳細評估質控品的凍融穩定性和短期、長期溫度穩定性。質控品的處理過程(如解凍過程)應包括在實驗室程序中。

若質控品廠商提供足夠的關于穩定性要求驗證的數據，其提供的關于質控品的穩定性和保存的相關信息可能需要使用到。在這種情況下，必須嚴格遵循廠商提供的保存信息。如果實驗室對商品化質控品產物做出改變(如稀釋以制備低濃度樣品)或保存條件與廠商要求不符，則實驗室必須驗證其保存要求和穩定性。

2 質控濃度和頻率

2.1 確定質控濃度 根據管理指南，對于定量檢測，在進行患者標本檢測時每24小時至少要檢測2個濃度的質控品。但對LC-MS/MS檢測而言，則需2個以上。LC-MS檢測需要考慮的一點是分析測量區間跨越許多量級的能力。若方法的分析測量區間很大，則需增加質控濃度數量以穩定評估方法在區間內的性能。例如，睪酮檢測要求包括多個決定域(男女均包括在內)，因此需增加額外的質控濃度。

作者建議將質控品濃度設定在醫學診斷點附近以輔助檢測是否有臨床上的顯著誤差。理想情況下，質控品濃度應覆蓋整個分析測量區間，包括測量區間上限(ULMI)和測量區間下限(LLMI)。質控品濃度應跨越分析測量區間以保證對所有測量值有足夠的方法性能，并保證檢測的線性沒有發生變化。建議最低有3個質控品濃度：1個在3倍LLMI附近，1個在測量區間的中間位置，1個在ULMI附近。此外，質控品濃度的位置在已知的分析麻煩點上或附近如LLMI和臨床決定閾可能有助于早期檢測失誤以滿足方法性能標準。

2.2 質控的最低頻率 如果檢測的動態范圍較大或一次運行中分析了相對較多的樣品，則應增加質控品檢測的數量(大于每24小時2個濃度)。作者建議一個批次中分析的質控品數量占總樣品數量至少5%或最少有6個質控品樣品(如3個濃度樣品每個檢測2次)。然而，方法要求的質控品分析頻率應最終反應方法驗證時建立的方法性能、一定時間內分析的樣品數和錯誤結果的臨床影響。日常檢測中應不斷再評價質控頻率。若方法較穩定可用最低分析頻率。若該方法表現出性能下降則應增加質控分析。質控樣品的位置應優化分析轉移、漂移或分析過程任一部分的誤差檢測。大樣品檢測的情況下通常將質控樣品放在該次運行的起始、中間和結束處，如大于50個樣品。在持續檢測狀態下，應在滿足方法轉移或漂移的前提下按固定頻率分析質控品，這樣就不太可能出現錯誤結果。使用質控趨勢規則和多規則或能更及時的檢測出方法性能下降[1，4]。

3 LC-MS法的額外質量控制樣品

以LC-MS為基礎的定量檢測要求額外監控QA和QC以保證檢測的色譜條件和質譜條件處于最佳狀態。

3.1 系統適應性評估 系統適應性檢測的目的是在分析前評價LC-MS系統的性能。用非提取樣品(如純溶液中的分析物或內標)確定基本儀器性能參數在預期范圍內。該樣品提供的系統性能信息與提取過程無關。儀器平衡及注入后，應分析系統適應性樣品。系統適應性樣品應至少檢測3次，其中第1次注入的結果應舍棄。可接受標準應包括方法驗證過程中建立的基礎色譜參數，如正確峰的存在、背景和分析物信號的強度、峰分辨率、保留時間和峰對稱性。系統適應性檢測失敗可能意味著系統性能出現問題，應對問題進行調查。建議至少在每次分析運行前和定期維修后，真空損失或當系統達到平衡后進行系統適應性樣品分析。

3.2 雙空白和空白樣品 雙空白樣品指的是不含分析物或內標的提取樣品。雙空白樣品的目的是監控LC系統和質譜儀的背景信號，同時檢測前面分析過程或高濃度樣品分析后的攜帶物。建議在每批次分析的起始和結束時及高濃度校準品或質控品分析后注入雙空白樣品。在特異性分析物躍遷中存在峰或峰面積小于20% LLMI可保證系統不具有背景噪音或攜帶物殘留。內標躍遷的峰面積應小于等于5%含內標樣品的峰面積。

空白樣品指的是含有內標但不含分析物的提取樣品。空白樣品的目的是確定降解的內標占分析物峰面積的百分比。空白樣品的分析物躍遷峰面積應小于20%的分析物LLMI。應在每批次檢測的起始和結束處分析空白樣品。

4 質控品可接受性評價

對于定量檢測，實驗室應在包含以前的質控品的批次內重復分析以建立可接受的QC均值和標準差。新批次質控品的評價程序見CLSI文件C24[1]。不論質控品是購買的還是實驗室自制的，實驗室都必須建立自己的質控品可接受標準。可接受標準取決于方法性能目標和臨床用途。不建議直接使用廠商提供的可接受性范圍，除非實驗室在使用前已經驗證過。

5 質控失控的糾正

質控失控后應調查原因并記錄采取的所有措施。應評價質控結果的數值可接受范圍和色譜可接受標準，如干擾峰、基線噪音、保留時間變換、峰對稱性和攜帶物。可允許范圍外的數值變異可能是由于程序上的錯誤、方法性能減退或儀器相關問題。

6 多組分和多重檢測的質控要求

LC-MS法的優勢之一在于注入一次樣品可以檢測多重分析物(如激素或藥物)。這種多組分法的QC應包含合適濃度的每種分析物。檢測中應建立每種分析物的QC可接受標準。如果分析物并非直接相關，某一分析物失控并不需要停止檢測其他分析物。但是如果檢測包含母體藥物及其代謝產物，則不論母體或代謝產物失控，都應停止檢測母體和代謝產物。

多重系統使用2個或以上的LC柱以提高LC-MS的產出。如果該系統含有兩條獨立的樣品發送模塊(如兩個注射器，兩個獨立的HPLC系統)，每個發送模塊可被視為一個獨立的系統并應服從控制。因此，每個傳送系統和色譜柱都應有自己的校準品和質控品。而有一些系統是組態的，即樣品間共用一個注射和傳送系統，但樣品在進入色譜柱以前分流開。相同的地方是一部分校準品在每個色譜柱中都需要分析，將兩個色譜柱的結果進行整合以得到完整的校準曲線。在這種情況下，應安排好運行順序以保證每個濃度的質控品在每個色譜柱中都得到了分析。

為了檢測某個色譜柱的問題，最好使用具有相同提取或樣品準備過程的分裝的質控品以評價色譜柱的一致性。應比較Levey-Jennings圖或其他QC轉移或漂移檢測機制的均值從而評估隨時間遷移時柱子間的可比性。校準品、質控品和試劑的批次變化確認應包括每個柱子。

7 周期性質量保證程序

7.1 質譜儀質量校準/調整 質譜儀質量校準/調整通常同時進行。質量校準指檢測特異性離子峰的正確質量值，通過注入質量校準標準品實現。質量調整指調整儀器參數如電壓和氣體流速以優化峰強度。如果質譜儀沒有做好質量校準/調整工作，可能會造成敏感度或特異性下降。質量校準和調整，或校準/調整驗證，應每6個月進行一次或根據廠商的要求。如果質量驗證證明系統不穩定的話，應更加頻繁地進行質量校準/調整工作。每個實驗室都應建立質量校準/調整的最低頻率和可允許總離子計數、離子強度、峰分辨率、質量躍遷的可接受標準。在維修、環境改變、儀器故障或儀器真空條件出現問題后應進行質量校準/調整或驗證。

7.2 多儀器間的相關性 通常某一檢測在多LC-MS系統間進行。每個LC-MS系統都應視為獨立的，即使附加儀器源于同一廠商或有相同的模式。若要將某一已建立好并已驗證過后的系統加入另一LC-MS系統中將需要進行方法驗證。但根據管理指南，可能需要一個限制性更強的驗證程序。限制性或部分驗證應“出于目的需要”，而且只有當方法性能中潛在差異很小的情況下才需要證明。限制性驗證范圍可能從LLMI、正確度、精密度和分析測量區間的評價等整個完整驗證過程，由實驗室主任負責完成。至少每6個月應進行儀器間的相關性驗證。可接受標準應基于方法性能標準和臨床效果。

7.3 新色譜柱的確認 本文所說的新色譜柱是指在初始方法驗證中從同一廠商處購買的并且與固定相類型相同的色譜柱。該色譜柱可能有或沒有新的批號。若使用不同的固定相或不同廠商的色譜柱則需要重新進行方法驗證。

不論是源于同一或不同廠商的新色譜柱的安裝都應視為試劑批號改變。驗證新色譜柱性能的過程應證明使用該新色譜柱是否能得到與之前相同的實驗結果。該驗證過程是在更換了色譜柱但不改變HPLC或MS的其他條件下分析5個先前分析過的基質合適的患者樣品。用于驗證新色譜柱的患者樣品的濃度應跨越分析測量區間。如果無法獲得患者樣品，應進行獨立線性檢測。已有關于新試劑批次的確認指南。應比較新色譜柱與舊色譜柱的結果，可接受標準應基于之前建立的色譜接受標準(如保留時間、背景信號、峰面積/高、分辨率和錯誤峰的舍棄)和方法性能要求。

7.4 新批號質控品、校準品和試劑的驗證 應驗證新批號質控品、校準品和試劑[1]。新批號商品化校準品或實驗室內新制備的校準品必須經過驗證以保證結果不會因為更換新的校準品而改變。在使用舊批次校準品進行方法校準的時候分析一組患者樣品，然后當更換新批次校準品進行校準時重新分析這些患者樣品。比較新舊批次中該組患者樣品結果的差異以預先確立可接受標準，基于方法驗證過程中建立的方法性能預期。或者，當方法用舊批次校準品時校準時，將新批次校準品視為未知樣品進行檢測，然后根據可接受標準比較新批次校準品的測定值與預期值間的差異。建議使用可溯源的新批次校準品進行驗證。

應對新批次試劑進行驗證。通常LC-MS檢測中的“新批次試劑”不好定義，如：在流動相其他成分保持不變的情況下用新批次的甲酸或甲酸銨來制備流動相所組成的“新試劑批次”是否算新批次？如果流動相的制備過程嚴格按照操作規程而且組成成分的批次沒有改變的情況下新制備的流動相是否算新批次？

實驗室需考慮勞動、支出和其他現實問題。最佳實踐建議是每個實驗室根據改變試劑成分的預期結果來定義“新批次試劑”。例如，用于準備提取試劑的新批次基質粉末可能會影響方法性能，因此，實驗室將其定義為試劑批次改變。實驗室應具有該方法使用的所有試劑成分和色譜柱的分析證明書。此外，新批次試劑成分開始使用的日期應記錄下來。

7.5 周期性正確度監控 建議進行LC-MS的周期性正確度監控。正確度監控應半年進行一次或當新批次校準品使用后進行。如果可能的話，建議使用具有給定值的可溯源到美國標準技術研究院(NIST)或檢驗醫學溯源聯合委員會(JCTLM)參考方法的校準品。如果已經證明可使用替代參考物質，實驗室應溯源校準品賦值以用于實驗室內自制校準品或沒有溯源至NIST或JCTLM參考測量程序的商品化校準品。關于溯源性和方法標準化的內容可參考CLSI文件EP32[10]。建議半年進行一次校準品溯源性確認。

8 其他質量保證方面

LC-MS法通常需要在分析前進行樣品轉換，如衍生化、提取、離心和加入樣品至自動注射器樣品瓶。整個檢測過程中應保持樣品標識完整以保證檢測結果與患者一一對應。有些實驗室已經采用了自動樣品準備過程，包括標本標識和追蹤能力，但大多數實驗室仍是手工完成的。實驗室必須建立一個體系以對所有進樣瓶貼上標簽或能追蹤其標識。此外，樣品標識必須與運行順序相連，從而使實驗室可以評估特定患者樣品、校準品或質控品的原始數據。

9 總 結

LC-MS的分析特異性比目前廣泛開展的診斷方法更高，如免疫法和酶法。正如免疫法從五十多年前開始發展至如今已經成為主要的診斷性檢測的自動化技術方法，MS也將繼續發展并對臨床實驗室產生重要影響，因此，LC-MS法的標準化至關重要。LC-MS如今在代謝紊亂、疾病掃描、激素定量、藥物治療監測、微生物有機體確定和藥物毒性/中毒的診斷中發揮重要作用[11]。雖然LC-MS的應用范圍很廣，但美國食品與藥品監督管理局(FDA)只批準了一項定量LC-MS檢測，其他LC-MS檢測項目屬于FDA分類的實驗室自建項目(LDT)。LC-MS檢測的重復性不是很理想，因此正確進行LC-MS檢測的質量控制和質量保證是檢測結果應用于臨床的重要方面。

LC-MS在臨床實驗室檢測中的重要性與日俱增，對LC-MS法的穩健性和協調性需求也越來越高，但與之相關的質量管理體系還有待持續發展。本文從LC-MS檢測的質量保證和質量控制著手，討論了質控品選擇、質控濃度和頻率、LC-MS的額外質量控制樣品、質控品可接受性評價、質控失控的糾正、多組分和多重檢測的質控要求、周期性質量保證程序和其他質量保證方面，希望對LC-MS檢測的質量控制和質量保證提供參考。

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[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.Laboratory quality control based on risk management;approved guideline：EP23-A[S].PA,USA:CLSI,2011.

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北京市自然科學基金資助項目(7143182)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.058

B

1673-4130(2016)24-3513-04

2016-06-16

2016-09-26)

△通訊作者,E-mail:zgwang@nccl.org.cn。