污染脅迫下的蚯蚓蛋白質組學研究進展

李德金，高宏生，張　麗，胡　驍，楊　震，李華英，郭　錦，趙化冰

中國人民武裝警察部隊后勤學院天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津　300309

污染脅迫下的蚯蚓蛋白質組學研究進展

李德金，高宏生，張麗，胡驍，楊震，李華英，郭錦，趙化冰*

中國人民武裝警察部隊后勤學院天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津300309

摘要:隨著蛋白質組學的發展和每年有大量環境污染物進入土壤環境中，污染脅迫模式動物的相關生物標志物受到日益關注。蚯蚓，作為土壤中最大的無脊椎動物，是研究和評價土壤生態污染良好的模式動物。研究蚯蚓的蛋白質組學，對于尋找環境生態污染相關生物標志物和闡明生態毒理學機制有著十分重要的現實意義。目前已知的污染脅迫下蚯蚓蛋白質組學研究，提供了幾個特定污染物脅迫蚯蚓的蛋白表達譜。這些蛋白涉及許多生物學過程，例如信號傳導、糖酵解、能量代謝、分子伴侶和轉錄調節，提示了相關污染物可能的生態毒理學機制，有望成為潛在的生物標志物，用于有毒污染物的監測，但其特異性需要進一步試驗的驗證。對蚯蚓受污染脅迫的蛋白質組表達譜及潛在生物標志物進行簡要綜述。

關鍵詞：蚯蚓；蛋白質組學；雙向電泳

土壤污染是一個環境污染的世界性問題，我國在這方面也日益突出。2014年調查結果顯示，部分地區土壤污染較重，耕地土壤環境質量堪憂，工礦業廢棄地土壤環境問題突出，全國土壤總的點位超標率為16.1%，其中重度污染點位比例為1.1%。另外，種植活動中農藥和養殖業中抗生素的使用，也使得土壤生態環境受到前所未有的巨大壓力。人們更多地關注如何快速、靈敏地監測土壤環境的受污染程度。

在土壤系統中，蚯蚓是最大的無脊椎動物，對分解活動、養分礦化和初級生產有著巨大的影響[1]，對土壤中的污染物也有不同程度的生理反應，被經濟合作與發展組織(OECD)和國際標準化組織(ISO)公認為用于研究化學物對土壤無脊椎動物毒理效應的模式動物[2- 3]，已經廣泛應用于土壤生態毒理學研究[4- 5]。目前，有關蚯蚓受土壤污染脅迫的生物標志物主要包括酶活性、溶酶體中性紅染色保持時間、金屬硫蛋白、熱休克蛋白、組織和超微結構變化、大分子加合物、DNA 損傷等，但是研究者越來越意識到，在特定生態系統內進行毒性效應的調查研究極大地得益于多重生物標志物的應用[6]。

近幾年研究表明，以雙向電泳為基礎的蛋白質組學在闡明環境污染物脅迫蚯蚓產生的毒理學效應和機制方面有著巨大的潛力[7]。本文就通過蛋白質組學發現的蚯蚓用于土壤污染潛在生物標志物進行概述。

1蛋白質組學的定義

蛋白質組學，以細胞、組織或器官內全基因組表達的所有蛋白的集合為研究對象[8- 9]，包括蛋白質的基本特征和結構、蛋白質表達、翻譯后修飾和蛋白質間的相互作用等[10]，能夠將單個蛋白或蛋白質組與疾病或中毒相聯系。與對照相比，在脅迫條件下產生的蛋白圖譜復雜程度并不妨礙蛋白表達具體變化的檢測和潛在作用方式的闡明[11]，之后這些蛋白可以作為某種疾病或毒物暴露的生物標志物。目前用于蛋白質組學研究的技術體系, 包括以雙向電泳和/或色譜為主的蛋白質分離技術和以質譜分析為主的蛋白質鑒定技術[12]。有關環境領域應用蛋白質組學的文獻數量日益增多，如今已涉及的范圍從微生物、植物到無脊椎動物(蠕蟲、昆蟲和蛤)、脊椎動物(淡水魚類和深海魚類)[13]。

2不同污染物脅迫下蚯蚓的蛋白質組學研究

Wang等人，在鎘(Cd)污染脅迫蚯蚓的研究中發現143個蛋白差異點，其中至少在一個時間點上有28個蛋白點上調和28個蛋白點下調，成功鑒定出51種蛋白[14]；在大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7)污染脅迫蚯蚓的研究中發現124個蛋白差異點，其中至少在一個時間點上有11個蛋白點上調和41個蛋白點下調，成功鑒定出42種蛋白[15]。Wu等人在菲(Phenanthrene, Phe)污染脅迫蚯蚓的研究中發現81個蛋白差異點，其中有36個蛋白點上調和45個蛋白點下調，成功鑒定出30種蛋白[7]。Ji等人在四溴聯苯醚(2, 2′, 4, 4′-tetrabromodiphenyl ether, BDE 47)污染脅迫蚯蚓的研究中發現28個蛋白差異點，其中有10個蛋白點上調和18個蛋白點下調，成功鑒定出24種蛋白[16]。吳石金等人在鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethylphthalate, DMP)污染脅迫蚯蚓的研究中發現140個蛋白差異點，成功鑒定5種蛋白[17]。這些鑒定出的蛋白主要分為五類(表1)：代謝功能、應激功能、防御功能、轉錄功能、翻譯功能，預測類別和假定類別因為大多功能分類不清，故不在本文討論范圍之內。

表1　不同污染物脅迫差異蛋白的質譜鑒定結果

2.1代謝方面

文獻中共鑒定出41種蛋白，涉及糖酵解、三羧酸循環、蛋白質合成與分解等生物學過程，其中至少有4種污染物脅迫研究中共同鑒定出的蛋白有:ATP合成β亞基(ATP synthase β subunit)、胍乙基磷酸絲氨酸激酶(Lombricine kinase)、纖溶蛋白酶(Fibrinolytic protease)。ATP合成酶是一種利用跨膜質子泵催化ADP與磷酸反應生成ATP的蛋白復合體，在線粒體中存在的主要是F1-F0型ATP合酶。線粒體是細胞內供能物質氧化和產生ATP的場所，其功能紊亂可能是導致修復病人肌肉糖代謝受損的關鍵因素[18]。胍乙基磷酸絲氨酸激酶，在動物體內能量產生和利用的耦合過程中起關鍵作用[19]。兩者表達量發生顯著變化表明，蚯蚓在受污染脅迫時，能量需求變化較為顯著，運動系統可能發生障礙。纖溶酶能夠溶解血栓，是一種重要的化療藥物[20]，污染脅迫后以下調為主，表明其在防御應答溶解纖維蛋白凝塊時起重要作用。

2.2應激方面

文獻中共鑒定出14種蛋白，涉及氧化還原、電子轉移、氧氣運輸等生物學過程，其中至少有3種污染物脅迫研究中共同鑒定出的蛋白有，醛脫氫同工酶A (Aldehyde dehydrogenase isoform A)、胞外球蛋白(Extracellular globin- 4)、類凝溶膠蛋白(Gelsolin-like proteins)、錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase, MnSOD)。老鼠在多種環境脅迫條件下體內可誘導產生醛脫氫酶[21]。Willuhn等人發現，基因Ebaldh可以編碼一種假定的醛脫氫酶，其表達能被鎘誘導增強[22]。這證明了線粒體中醛脫氫酶的上調可能是蚯蚓應對污染物脅迫的有效解毒機制。胞外球蛋白與氧運輸有關，脅迫下以下調為主。有研究稱，血紅蛋白的功能可能包括抗氧化防御作用[23]。凝溶膠蛋白在血管平滑肌收縮功能和運動能力發生改變時很可能起重要作用，其表達量的增加可能是蚯蚓抵御和消除污染物的機制。活性氧，是有氧代謝或氧化劑暴露后的副產物，當他們損傷核酸、蛋白和膜脂時，具有毒性或致命性。為了對抗這些具有潛在損傷特性的活性氧，需氧生物已經進化出一套由抗氧化酶系統(SODs)組成的酶防御體系[24]。錳超氧化物歧化酶就是其中之一，它能夠在細胞溶質內合成并修飾后進入線粒體基質[25]。

2.3防御方面

文獻中共鑒定出4種蛋白，主要作用是抵抗細菌，其中至少有3種污染物脅迫研究中共同鑒定出的蛋白有，體腔細胞溶解因子(Coelomic cytolytic factor, CCF)，胞溶素(Lysenin)，胞溶素相關蛋白2(Lysenin-related protein 2, LRP- 2)。Engelmann等人已證明蚯蚓的自然免疫依賴于體腔細胞合成和分泌的體液抗菌分子(CCF, Lysenin, and Lumbricin I等)[26]。在環節動物體內，體腔細胞溶解因子是一種類似于哺乳動物腫瘤壞死因子的防御分子，其在免疫應答調節中起重要作用[27- 28]，細菌刺激可引起其生物合成量上調[27- 29]。胞溶素是一種存在于赤子愛勝蚓體液中的造孔毒素，由包括胞溶素相關蛋白1 (LRP- 1, lysenin 2)和胞溶素相關蛋白2 (LRP- 2, lysenin 3)在內的蛋白家族構成[30]。Yamaji等人研究發現，能夠特異性的與鞘磷脂結合并引起紅細胞溶解[31- 33]，已被證明可以引起大鼠血管平滑肌的收縮[34]。另外，胞溶素相關蛋白2可以清除線粒體內具有潛在毒性的超氧自由基[35]。

2.4轉錄和翻譯

轉錄方面，文獻中共鑒定出3種蛋白，其中至少有3種污染物脅迫研究中共同鑒定出的蛋白相關基因有Orthodenticle (Otd)。Otd是無脊椎動物體內調節激活轉錄相關的成形基因[36- 38]，也是果蠅嗅覺突觸神經元和局部中間神經元發育所必需的[39]。翻譯方面，文獻中共鑒定出2種蛋白，其中至少有兩種污染物脅迫研究中共同鑒定出的蛋白有40s核糖體蛋白SA型(40S ribosomal protein SA)和鳥嘌呤核苷酸結合蛋白β亞基(Guanine nucleotide-binding protein subunit beta)。前者屬于核糖體家族，主要作用是把RNA和蛋白質組裝成核糖體亞小單位，而后者主要參與信號傳導活動[40- 41]。

3存在問題和展望

蛋白質組學以組織、器官或生物體所包含的全部蛋白質為出發點，考察外源化學毒物對生物體所產生的毒性效應及其導致的生物體內代謝通路的改變，可以更加全面發現生物體內蛋白水平細微的變化及其變化之間的聯系，為研究者分析污染物的毒性機制和生物體的防御機制提供了基礎。目前已知的污染脅迫下蚯蚓蛋白質組學研究，提供了幾個特定污染物脅迫蚯蚓的蛋白表達譜。這些蛋白涉及許多生物學過程，例如信號傳導、糖酵解、能量代謝、分子伴侶和轉錄調節，提示了相關污染物可能的生態毒理學機制，有望成為潛在的生物標志物，用于污染物毒性監測，但其特異性需要進一步試驗的驗證。

雙向電泳技術分離蛋白的范圍較窄，實驗操作的主觀性強，難以保證實驗的重復性。而目前分離范圍更加廣泛、通量更高的二維液相串聯質譜技術與包括iTRAQ (Isobaric Tags For Relative And Absolute Quantitation)技術在內的同位素標記方法的結合，極大地提高了蛋白質的檢測量，進而找到更多的潛在生物標志物。蛋白質組學研究不僅依賴高通量的蛋白分離技術和質譜鑒定手段，還需要蛋白質組和基因組數據庫的支持。蚯蚓基因組沒有進行完整的測序，許多鑒定出的蛋白質功能也只能依靠與其基因表達序列高度相似和同源性較高的基因轉錄翻譯的蛋白功能進行注釋。因此，質譜所鑒定出的蛋白質序列或經過測序所得DNA序列的功能一般是不能在相關數據庫中準確地匹配。

總之，蛋白質組學在環境污染生態領域，尤其是污染物脅迫蚯蚓的研究中，有著極為廣闊的應用前景，如能對蚯蚓的全基因組測序，將對后續蛋白質組學研究及土壤生態污染診斷和污染修復也會有很大的幫助。

參考文獻(References):

[1]Coleman D C, Ingham E R. Terrestrial nutrient cycles. Biogeochemistry, 1988, 5(1): 3- 5.

[2]OECD. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2: Test No. 207: earthworm, acute toxicity tests. Organization for Economic Cooperation and Development, Paris, France. 1984.

[3]ISO. ISO 11268- 1 Soil quality-effects of pollutants on earthworms (Eiseniafetida)-Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate. 1993.

[4]Bundy J G, Keun H C, Sidhu J K, Spurgeon D J, Svendsen C, Kille P, Morgan A J. Metabolic profile biomarkers of metal contamination in a sentinel terrestrial species are applicable across multiple sites. Environmental Science and Technology, 2007, 41(12): 4458- 4464.

[5]Bundy J G, Lenz E M, Bailey N J, Gavaghan C L, Svendsen C, Spurgeon D, Hankard P K, Osborn D, Weeks J M, Trauger S A, Speir P, Sanders I, Lindon J C, Nicholson J K, Tang H R. Metabonomic assessment of toxicity of 4-fluoroaniline, 3, 5-difluoroaniline and 2-fluoro- 4-methylaniline to the earthwormEiseniaveneta(Rosa): identification of new endogenous biomarkers. Environmental Toxicology and Chemistry, 2002, 21(9): 1966- 1972.

[6]Depledge M H, Galloway T S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment, 2005, 3(5): 251- 258.

[7]Wu S J, Xu X, Zhao S L, Shen F C, Chen J M. Evaluation of phenanthrene toxicity on earthworm (Eiseniafetida): an ecotoxicoproteomics approach. Chemosphere, 2013, 93(6): 963- 971.

[8]Wilkins M R, Sanchez J C, Williams K L, Hochstrasser D F. Current challenges and future applications for protein maps and post-translational vector maps in proteome projects. Electrophoresis, 1996, 17(5): 830- 838.

[9]Wasinger V C, Cordwell S J, Cerpa-Poljak A, Yan J X, Gooley A A, Wilkins M R, Duncan M W, Harris R, Willimams K L, Humphery-Smith I. Progress with gene-product mapping of theMollicutes:Mycoplasmagenitalium. Electrophoresis, 1995, 16(7): 1090- 1094.

[10]Banks R E, Dunn M J, Hochstrasser D F, Sanchez J C, Blackstock W, Pappin D J, Selby P J. Proteomics: new perspectives, new biomedical opportunities. Lancet, 2000, 356(9243): 1749- 1756.

[11]Blackstock W P, Weir M P. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Trends in Biotechnology, 1999, 17(3): 121- 127.

[12]Ashton P D, Curwen R S, Wilson R A. Linking proteome and genome: how to identify parasite proteins. Trends in Parasitology, 2001, 17(4): 198- 202.

[13]Nesatyy V J, Suter M J F. Proteomics for the Analysis of Environmental Stress Responses in Organisms. Environmental Science and Technology, 2007, 41(20): 6891- 6900.

[14]Wang X, Chang L, Sun Z J, Zhang Y F, Yao L. Analysis of earthwormEiseniafetidaproteomes during cadmium exposure: an ecotoxicoproteomics approach. Proteomics, 2010, 10(24): 4476- 4490.

[15]Wang X, Chang L, Sun Z J, Zhang Y F. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the earthwormEiseniafetidaduringEscherichiacoliO157: H7 stress. Journal of Proteome Research, 2010, 9(12): 6547- 6560.

[16]Ji C L, Wu H F, Wei L, Zhao J M, Lu H J, Yu J B. Proteomic and metabolomic analysis of earthwormEiseniafetidaexposed to different concentrations of 2, 2′, 4, 4′-tetrabromodiphenyl ether. Journal of Proteomics, 2013, 91: 405- 416.

[17]吳石金, 沈飛超, 胡航. 蛋白質組學技術篩選與鑒定DMP脅迫下蚯蚓表皮組織的差異蛋白. 浙江工業大學學報, 2014, 42(1): 1- 5.

[18]H?jlund K, Wrzesinski K, Larsen P M, Fey S J, Roepstorff P, Handberg A, Dela F, Vinten J, McCormack J G, Reynet C, Beck-Nielsen H. Proteome analysis reveals phosphorylation of ATP synthase β-subunit in human skeletal muscle and proteins with potential roles in type 2 diabetes. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(12): 10436- 10442.

[19]Ellington W R. Evolution and physiological roles of phosphagen systems. Annual Review of Physiology, 2001, 63: 289- 325.

[20]Park Y, Ryu E, Kim H, Jeong J, Kim J, Shim J, Jeon S, Jo Y, Kim W, Min B. Characterization of antithrombotic activity of lumbrokinase-immobilized polyurethane valves in the total artificial heart. Artificial Organs, 1999, 23(2): 210- 214.

[21]T?rr?nen R, Korkalainen M, K?renlampi S O. Induction of class 3 aldehyde dehydrogenase in the mouse hepatoma cell line HEPA- 1 by various chemicals. Chemico-Biological Interactions, 1992, 83(2): 107- 119.

[22]Willuhn J, Schmitt-Wrede H P, Otto A, Wunderlich F. Cadmium-detoxification in the earthwormEnchytraeus: specific expression of a putative aldehyde dehydrogenase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, 226(1): 128- 134.

[23]Nishi H, Inagi R, Kato H, Tanemoto M, Kojima I, Son D, Fujita T, Nangaku M. Hemoglobin is expressed by mesangial cells and reduces oxidant stress. Journal of the American Society of Nephrology, 2008, 19(8): 1500- 1508.

[24]Dash B, Metz R, Huebner H J, Porter W, Phillips T D. Molecular characterization of two superoxide dismutases fromHydravulgaris. Gene, 2007, 387(1/2): 93- 108.

[25]Halliwell B, Gutteridge J, Gutteridge J M C. Free Radicals in Biology and Medicine. England: Oxford University Press, 1999.

[26]P Engelmann, E L Cooper, P Németh. Anticipating innate immunity without a Toll. Molecular Immunology, 2005, 42(8): 931- 942.

[27]K?hlerová P, Beschin A,ilerová M, De Baetselier P, Bilej M. Effect of experimental microbial challenge on the expression of defense molecules inEiseniafoetidaearthworm. Developmental and Comparative Immunology, 2004, 28(7/8): 701- 711.

[28]Zhang X M, Luan W, Jin S J, Xiang J H. A novel tumor necrosis factor ligand superfamily member (CsTL) fromCionasavignyi: molecular identification and expression analysis. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(11): 1362- 1373.

[29]Liu X L, Sun Z J, Chong W, Sun Z T, He C K. Growth and stress responses of the earthwormEiseniafetidatoEscherichiacoliO157: H7 in an artificial soil. Microbial Pathogenesis, 2009, 46(5): 266- 272.

[30]Kiyokawa E, Makino A, Ishii K, Otsuka N, Yamaji-Hasegawa A, Kobayashi T. Recognition of sphingomyelin by lysenin and lysenin-related proteins. Biochemistry, 2004, 43(30): 9766- 9773.

[31]Yamaji A, Sekizawa Y, Emoto K, Sakuraba H, Inoue K, Kobayashi H, Umeda M. Lysenin, a novel sphingomyelin-specific binding protein. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(9): 5300- 5306.

[32]Kobayashi H, Ohtomi M, Sekizawa Y, Ohta N. Toxicity of coelomic fluid of the earthwormEiseniafoetidato vertebrates but not invertebrates: probable role of sphingomyelin. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2001, 128(3): 401- 411.

[33]Sukumwang N, Umezawa K. Earthworm-derived pore-forming toxin lysenin and screening of its inhibitors. Toxins, 2013, 5(8): 1392- 1401.

[34]Sekizawa Y, Kubo T, Kobayashi H, Nakajima T, Natori S. Molecular cloning of cDNA for lysenin, a novel protein in the earthwormEiseniafoetidathat causes contraction of rat vascular smooth muscle. Gene, 1997, 191(1): 97- 102.

[35]Wong G H, Goeddel D V. Induction of manganous superoxide dismutase by tumor necrosis factor: possible protective mechanism. Science, 1988, 242(4880): 941- 944.

[36]Gao Q, Finkelstein R. Targeting gene expression to the head: theDrosophilaorthodenticlegene is a direct target of thebicoidmorphogen. Development, 1998, 125(21): 4185- 4193.

[37]Schr?der R. The genesorthodenticleandhunchbacksubstitute forbicoidin the beetleTribolium. Nature, 2003, 422(6932): 621- 625.

[38]Lynch J A, Brent A E, Leaf D S, Pultz M A, Desplan C. Localized maternalorthodenticlepatterns anterior and posterior in the long germ waspNasonia. Nature, 2006, 439(7077): 728- 732.

[39]Sen S, Biagini S, Reichert H, VijayRaghavan K.Orthodenticleis required for the development of olfactory projection neurons and local interneurons inDrosophila. Biology Open, 2014, 3(8): 711- 717.

[40]Song D G, Kim Y S, Jung B C, Rhee K J, Pan C H. Parkin induces upregulation of 40S ribosomal protein SA and posttranslational modification of cytokeratins 8 and 18 in human cervical cancer cells. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171(7): 1630- 1638.

[41]Du Y, Meng J Y, Huang Y H, Wu J, Wang B, Ibrahim M M, Tang J W. Guanine nucleotide-binding protein subunit beta- 2-like 1, a new annexin A7 interacting protein. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2014, 445(1): 58- 63.

Advances in proteomic studies on earthworms subjected to pollution stress

LI Dejin, GAO Hongsheng, ZHANG Li, HU Xiao, YANG Zhen, LI Huaying, GUO Jin, ZHAO Huabing*

TianjinKeyLaboratoryforPreventionandControlofOccupationalandEnvironmentalHazard,LogisticUniversityofChinesePeopleArmedPoliceForce,Tianjin300309,China

Abstract：With the advancement in proteomics research and yearly introduction of numerous environmental contaminants into the soil, development of biomarkers to detect contaminant-responsive proteins in model organisms is receiving increasing attention. Earthworms are the largest group of invertebrates in soil; they are a good model system for evaluating ecological soil pollution. Therefore, detecting contaminant-responsive biomarkers and elucidating the ecotoxicological mechanism in earthworms by using proteomics is of important practical significance. The protein expression profiles of earthworms subjected to several specific pollutants have been investigated. These proteins are associated with many biological processes such as signal transduction, glycolysis, energy metabolism, and chaperone and transcriptional regulation and can be used to determine the possible ecotoxicological mechanisms of relevant contaminants and as potential biomarkers for monitoring toxic contaminants. However, their specificity needs to be determined. In this study, we provided a brief overview of the protein expression profiles and identified potential biomarkers in earthworms subjected to pollution stress.

Key Words:earthworm; proteomics; two-dimensional electrophoresis

DOI:10.5846/stxb201408251676

*通訊作者Corresponding author.E-mail: 13820664530@163.com

收稿日期:2014- 08- 25;

修訂日期:2015- 07- 10

基金項目:國家自然科學基金重點項目(21037002)；天津市應用基礎與前沿研究計劃重點項目“萘降解過程中兒茶酚間位和鄰位途徑協同作用機制研究”；武警后勤學院創新團隊項目(WHDT201303)

李德金，高宏生，張麗，胡驍，楊震，李華英，郭錦，趙化冰.污染脅迫下的蚯蚓蛋白質組學研究進展.生態學報,2016,36(1):44- 50.

Li D J, Gao H S, Zhang L, Hu X, Yang Z, Li H Y, Guo J, Zhao H B.Advances in proteomic studies on earthworms subjected to pollution stress.Acta Ecologica Sinica,2016,36(1):44- 50.