Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網膜病變患者血漿中的表達

李沭巖，張　磊，張愛華

?

·臨床研究·

Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網膜病變患者血漿中的表達

李沭巖1，張磊2，張愛華3

Abstract

?AIM:To observe the effects of Dickkopf-3 (Dkk-3) in diabetic retinopathy (DR) circulating blood in patients with the expression level,the Dkk-3 development changes in the diabetic retinopathy of significance in the diagnosis of early DR.

?METHODS:Eighty-five type 2 diabetic patients,included the non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) 23 patients,proliferative diabetic retinopathy,proliferative DR (PDR) in patients with 30 and non-diabetic retinopathy (NDR) with 32 cases.The same period of healthy physical examination was selected as control group (80 cases).Serum samples were collected,and the relative expression level of Dkk-3 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) double antibody sandwich assay.The statistical differences were compared between groups.

?RESULTS:The plasma level of Dkk-3 (430.16±198.11pg/mL) in DR patients was significantly lower than that in healthy control group (627.48±294.45 pg/mL; P<0.05) and NDR patients (601.99±194.16 pg/mL; P<0.05).While there was no significant difference in Dkk-3 level between NDR and healthy control group (P=0.729).The level of PDR in patients with Dkk-3 (396.38±185.59 pg/mL) was lower than that of NPDR (538.82±187.20 pg/mL; P=0.002).

?CONCLUSION:The decrease of Dkk-3 level may be related to the occurrence and development of diabetic retinopathy,and there is a significant correlation with PDR.Circulating blood Dkk-3 protein in diabetic retinopathy has a certain differential efficacy,it is likely to become diabetic retinopathy patients peripheral blood test indicators.

目的：觀察Dickkopf-3在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)患者循環血中的表達水平，研究Dickkopf-3在糖尿病視網膜病變發生發展中的變化，探討其在糖尿病視網膜病變早期診斷中的意義。

方法：選擇2型糖尿病患者85例，其中非增殖期糖尿病視網膜病變(non-proliferative DR，NPDR)患者23例、增殖期糖尿病視網膜病變(proliferative DR，PDR)患者30例及無視網膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)患者32例。選擇同期健康體檢者為對照組(80例)。收集血清樣本，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)雙抗體夾心法檢測循環血中Dickkopf-3的相對表達水平，并比較各組血漿Dickkopf-3的水平。

結果：糖尿病視網膜病變患者血漿Dickkopf-3平均含量為430.16±198.11pg/mL，明顯低于健康對照組(627.48±294.45pg/mL)及無視網膜病變患者(601.99±194.16pg/mL)，差異有統計學意義(P<0.05)；而無視網膜病變與健康對照組Dickkopf-3水平比較，差異無統計學意義(P=0.729)；增殖期糖尿病視網膜病變患者Dickkopf-3的水平(396.38±185.59pg/mL)低于非增殖期糖尿病視網膜病變患者(538.82±187.20pg/mL)，差異有統計學意義(P=0.002)。

結論：Dickkopf-3蛋白水平降低可能與糖尿病視網膜病變的發生發展有關，與增殖期糖尿病視網膜病變有顯著相關性。循環血中Dickkopf-3蛋白對糖尿病視網膜病變具備一定的鑒別效能，有可能成為糖尿病視網膜病變患者外周血的檢測指標。

糖尿病視網膜病變；Dickkopf-3；循環血液

引用：李沭巖，張磊，張愛華.Dickkopf-3蛋白在糖尿病視網膜病變患者血漿中的表達.國際眼科雜志2016;16(10):1891-1893

0　引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)的微血管并發癥，其致病機制十分復雜，視網膜微血管功能障礙是其主要的病變特征。它的病變可累及視網膜、玻璃體，可致牽拉性視網膜脫離出血和新生血管性青光眼以及虹膜紅變等嚴重并發癥。若不給予積極治療，可能迅速進展為增生性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，嚴重影響視力，通常預后不良[1-2]。近來有研究表明，Dickkopf-3(Dkk-3)與進展中血管生長密度的上調及某些腫瘤生長轉移顯著相關。它是一種分泌性糖蛋白，是Dickkopf(Dkk)家族中的一員[3]，表現出一些與其他家族成員不相同的性質，對其生物學功能至今仍然不十分清楚。以往關于Dkk-3的研究多局限于腫瘤發生與發展中的作用，隨著相關研究的逐步深入，陸續發現其作為分化因子參與腫瘤血管重塑，因而引起廣泛關注。因此本研究擬測定DR患者相關危險因素及Dkk-3的含量，就其差異性變化進行深入探討，從而為臨床診斷提供理論依據。

1　對象和方法

1.1對象

1.1.1病例選擇選取2014-10/2015-10在我院門診就診的2型DM患者85例，其中男43例，女42例，年齡40～70(平均56.46±8.66)歲。選擇同時期健康體檢者為對照組(normal control，NC)80例，其中男44例，女36例，年齡60.24±10.85歲，雙眼散瞳檢查眼底為正常。納入標準：符合2002年制定的國際DR分級標準；空腹血糖控制在8mmol/L以下；簽署知情同意書。排除標準：全身感染、腫瘤、合并腦出血或腦梗死、心肌梗死、酮癥酸中毒、風濕結締組織病；屈光間質明顯混濁、青光眼、其他的眼內新生血管性疾病、眼部激光及手術史者；近期應用腎毒性藥物；其他原因引起的視網膜脈絡膜病變。

1.1.2分組方法根據散瞳后直接檢眼鏡、眼底照相或眼底熒光造影檢查，按照有無視網膜病變將患者分為三組：無明顯視網膜病變NDR(non-DR，NDR)、非增殖期糖尿病視網膜病變(non-proliferative DR，NPDR)、增殖期糖尿病視網膜病變(proliferative DR，PDR)。NDR組32例，其中男13例，女19例，年齡35～65歲； DR組53例，其中男30例，女23例，年齡40～70歲，NPDR組23例，PDR組30例。各組間年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法標本采集與測定：采用無抗凝劑干燥試管，抽取空腹靜脈血5mL。30min內高速離心分離(4000r/min離心10min后，3000r/min離心15min)。外周血被分為兩層，即血漿層和血細胞層；取上清分裝于Ep管中，-80℃保存。使用血漿時，為避免多次反復凍融，于4℃融解備用。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)雙抗體夾心法測定，使用購買的Human-Dkk3 Quantikine ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書進行嚴格操作。

2　結果

健康對照組、NDR組和DR組血漿Dkk-3水平分別為627.48±294.45、601.99±194.16、430.16±198.11pg/mL。由于Dkk-3濃度均呈正態分布(Kolmogorov-Smimov檢驗，P>0.05)，故這三組間Dkk-3水平的比較采用方差分析，結果顯示差異具有顯著統計學意義(F=7.637，P<0.01)。兩兩比較(采用Tamhane分析，方差不齊)的結果顯示，DR組的血漿Dkk-3水平低于健康對照組及NDR組，差異有顯著統計學意義(P<0.01)；而Dkk-3水平在NDR組與健康對照組比較，差異無統計學意義(P=0.729)。明顯視網膜病變中，增殖期糖尿病視網膜病變和非增殖期Dkk-3水平分別為396.38±185.592、538.82±187.20pg/mL，PDR組的血漿Dkk-3水平低于NPDR組，差異有顯著統計學意義(t=2.466，P=0.002)。

3　討論

近年來，糖尿病患病率不斷增加，而DR作為糖尿病最常見和嚴重的微血管并發癥之一，給個人和社會都帶來沉重的經濟和社會負擔。初次診斷2型糖尿病的患者DR發生率就可達12.4%，病程≥15a視網膜病變的發生危險可高達78%[4-5]。早期發現、早期診斷、早期干預，降低糖尿病人群的糖尿病視網膜病變發生幾率，減少其對人類健康的影響，降低國家經濟負擔，已經成為目前世界所面臨的新問題。但目前早期診治方法尚缺乏，深入研究DR潛在的發病機制，尋找新的診治靶點迫在眉睫。

Dkk家族由Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4和Dkk-3的相關蛋白Soggy(Sgy)組成，對細胞的發生、發展、增殖、極性的控制有著非常重要的功能[6-7]。Wnt信號通路參與機體的多種病理生理過程，如調控細胞的分化、增殖、凋亡和黏附，調控機體免疫及機體應激等。眾多腫瘤的發生與其異常持續性激活相關，特別是上皮性腫瘤的發病過程。Wnt信號通路的異常激活可誘導包括VEGF、細胞間黏附分子、腫瘤壞死因子、IL-8、MMP-2、MMP-9等許多靶基因的表達[8]，它們與炎癥及新生血管形成有關，介導炎癥過程以及新生血管形成[9-10]。Dkk-3是Wnt信號通路的拮抗因子，是腫瘤抑制基因，位于人類染色體11p5.1的位點，全長約47 100bp，包含9個外顯子，2個啟動子，Dkk-3的起始密碼位于第2個外顯子上。Dkk-3位于細胞質內，包含350個氨基酸，該基因所編碼的蛋白可以阻止Wnt信號傳導通路的途徑，其在很多腫瘤組織中的表達均下凋，如腎癌[11]、胃癌[12]和神經膠質瘤[13]等。Dkk-3可能在腫瘤細胞的生長、轉移，以及在腫瘤治療與預后中均起著重要作用。近年有研究表明，在結直腸癌、胃癌[14]及其癌旁組織中，Dkk-3陽性樣本比陰性樣本的平均微血管計數明顯多，Dkk-3的表達陽性樣本中也增加，而在正常黏膜樣本微血管表現為Dkk-3陰性，從而推測Dkk-3可能是新生血管形成過程中的一種前血管源性蛋白，或者是一種標記，標記新生血管的形成[15]。

本研究發現，DR患者比健康對照組及無視網膜病變的糖尿病患者組血漿Dkk-3濃度明顯降低。NC組和NDR組患者的Dkk-3水平差異無統計學意義(P>0.05)。DR患者中，PDR組血漿Dkk-3水平要低于NPDR組。DR的基本病理學改變是新生血管的形成和血-視網膜屏障的破壞。PDR是DR的發展晚期，伴隨視網膜新生血管的形成，易導致玻璃體出血、視網膜脫離。本研究結果表明，Dkk-3的降低與糖尿病的發生無明顯關系，與PDR的發生有關，提示低水平的Dkk-3可能是PDR發生的高危因素。當Dkk-3降低，糖尿病患者發生PDR的風險升高，兩者有顯著的關聯性。這也說明Dkk-3的降低與眼內新生血管的發生相關。而血漿中的Dkk-3水平的降低是如何參與PDR及新生血管形成，還有待進一步的研究。

糖尿病視網膜病變是非常嚴重的致盲性眼病，早期的診斷、早期干預非常關鍵。Dkk-3的測定或許有助于糖尿病視網膜病變的早期診斷及監測病情的發展，或許可以成為一種理想的檢查糖尿病視網膜病變的輔助檢查方法。

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13De Brouwer S，mestdagh P，Lambertz I,et al.Dickkopf-3 is regulated by the MYCN-induced miR-17-92 cluster in neuroblastoma.Int J Cancer 2012;130(11)：2591-2598

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15Zitt M，Untergasser G，Amberger A，et al.Dickkopf-3 as a new potential marker for neoangiogenesis in colorectal cancer：expression in cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue.Dis Markers 2008;24(2)：101-109

Study on the expression of Dickkopf-3 protein in diabetic retinopathy

Shu-Yan Li1,Lei Zhang2,Ai-Hua Zhang3

Research Project for Rehabilitation of Disabled People in Shanghai (No.K2014011)

Lei Zhang.Department of Ophthalmology,the Seventh People’s Hospital of Shanghai,Shanghai 200137,China.apple_lsy@163.com

2016-06-12Accepted：2016-08-23

diabetic retinopathy; Dickkopf-3; circulating

上海市殘疾人康復科研項目資助課題(No.K2014011)

1(200090)中國上海市，同濟大學附屬楊浦醫院眼科；2(200137)中國上海市第七人民醫院眼科；3(201700)中國上海市青浦區中心醫院眼科

李沭巖，碩士，主治醫師，研究方向：眼底病。

張磊，博士，碩士研究生導師，主任醫師，主任，研究方向：眼底病的臨床與基礎研究.apple_lsy@163.com

2016-06-12

2016-08-23

1Department of Ophthalmology,Yangpu Hospital Affiliated to Medical College of Shanghai Tongji University,Shanghai 200090,China;2Department of Ophthalmology,the Seventh People’s Hospital of Shanghai,Shanghai 200137,China;3Department of Ophthalmology,Qingpu District Central Hospital of Shanghai,Shanghai 201700,China

Li SY,Zhang L,Zhang AH.Study on the expression of Dickkopf-3 protein in diabetic retinopathy.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1891-1893

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.26