藥物介導的自噬改變對腫瘤細胞放射敏感性的影響

徐召南，王舒煜，畢也，胡月，周麗佳，張澤兵

(吉林大學口腔醫院病理科，吉林長春130021)

藥物介導的自噬改變對腫瘤細胞放射敏感性的影響

徐召南，王舒煜，畢也，胡月，周麗佳，張澤兵

(吉林大學口腔醫院病理科，吉林長春130021)

放射治療誘導的自噬與導致細胞死亡的凋亡起到的作用不同，其具有既可以導致細胞死亡又可以保護細胞生存的雙重性。自噬這一過程在放射治療和輻射毒性中的抗腫瘤效應還不明確。一系列藥物試驗已經證實誘導或者抑制自噬，直接影響細胞毒性和放射治療的效果，同時發生的目標性自噬和凋亡似乎進一步增強了放射治療的抗腫瘤效應。本文就調節放射誘導的自噬在腫瘤細胞中作用的研究進展進行簡要綜述。

自噬；放射治療；誘導；腫瘤細胞；研究；進展

放射治療在眾多人類惡性腫瘤治療方法中有較高的治愈率。電離輻射誘導的不可逆DNA雙鏈破壞可活化正常細胞或癌細胞內蛋白酶，進而導致細胞凋亡。輻射后，細胞G2/M節點控制減少，導致自發性成熟前染色體濃縮和有絲分裂破壞，該途徑被認為是一種輻射誘導細胞死亡的主要途徑。有絲分裂破壞是有絲分裂延遲的結果。在有絲分裂延遲的細胞中，M期染色質濃縮直接導致細胞凋亡或者經歷異常分裂致使微核和非整倍體核形成導致細胞死亡。然而因為腫瘤細胞對放射治療的抗性使某些腫瘤的治療效果并不理想。由于放射誘導的自噬作用在多種腫瘤細胞中都起到了作用。所以，研究通過調節自噬水平影響腫瘤細胞的放射敏感性及放射毒性，得到了廣泛的重視。以下我們將通過迄今為止有限的研究結果，說明放射誘導的自噬在腫瘤細胞中的作用，并展望這一研究領域在臨床實踐中的益處。

1 自噬

自噬也被稱為Ⅱ型細胞程序性死亡，是消化和循環利用長壽命蛋白、成熟核糖體，甚至全部細胞器包括內質網高爾基體和線粒體的一種細胞內途徑[1]。因此，自噬作用是一種用于持續更新細胞內蛋白質細胞器的細胞內作用，是維持細胞內穩定狀態的必需品。自噬由最近發現的自噬相關基因家族調控，即ATG家族。它是一種維持內環境穩定的自我降解過程，同時在移除錯誤折疊或聚集的蛋白質，清除受損的細胞器，如線粒體、內質網和過氧化物酶，以及消除細胞內的病原體這些過程中，也起到了“管家”的作用。因此，自噬普遍被認為是一種生存機制。然而，調節它的功能同樣可以導致非凋亡性細胞死亡。除了消除細胞內的聚集體和受損的細胞器，細胞的自噬作用還可以促進細胞的老化和表面抗原的表達，可以針對基因組的不穩定性提供保護，同時防止壞死[2]。

在哺乳動物細胞中有主要有三種自噬形式，即巨自噬(Macro-autophagy)、微自噬(Micro-autophagy)、分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy)。巨自噬以被稱作自噬小體的雙層膜泡結構作為媒介傳送細胞質內的物質，自噬小體再與溶酶體融合形成自噬溶酶體。與之相比，微自噬則是溶酶體直接通過它自身膜的內陷攝取胞質內物質。在分子伴侶介導的自噬中，由可溶性胞質內蛋白組成的池特定的池被分子伴侶/分子伴侶復合物識別，傳遞至溶酶體中[3]。簡單起見，本文重點在于巨自噬，以下將用術語“自噬”代替。

自噬的核心機制主要有三種官能團組成：(1)ATG9及其系統；(2)磷脂酞肌醇三磷酸激酶(PΙ3K)及其復合物；(3)泛素樣蛋白質系統，它包括兩個泛素樣蛋白，ATG12和ATG8(哺乳動物同源MAP1LC3/LC3)[3]。

自噬由致癌基因和抑癌基因以及其他分子機制共同調節。多重致癌基因可以通過PΙ3K/AKT/mTOR途徑和抗凋亡蛋白功能作用從而下調自噬功能，反之，用雷帕霉素類似物(西羅莫司、替西羅莫司、依維莫司)和bcl-2抑制劑激活這些分子機制可以誘導自噬[4]。同樣，一些腫瘤抑制蛋白，如死亡相關蛋白激酶1 DAPK1、PTEN和BNΙP3L誘導自噬，而其丟失則降低細胞自噬水平[5]。此外，輻射可以通過由于錯誤折疊的蛋白質積累而導致的適應性內質網應激反應激活自噬。內質網應激反應是由錯誤折疊的蛋白質積累通過上調atg12增加了LC3的轉化，并且刺激自噬反應。

2 自噬和腫瘤細胞

在對腫瘤細胞進行放射治療和化學治療時，不同于凋亡作用會導致細胞死亡，自噬起到促使細胞存活和導致細胞死亡的雙重作用。自噬過程可能同時是細胞死亡或者生存趨勢的指示[6]。在放射治療中，放射生物學家們探究腫瘤細胞表型和自噬性反應在存細胞死亡或存活之間的轉化是很有意義的。

2.1 自噬與前列腺癌細胞萊菔硫烷(Sulforaphane)，一種存在于幾種食用十字花科蔬菜中的抗腫瘤成分，在人前列腺癌PC-3和LNCaP細胞株中可以誘導自噬[7]。研究中，自噬的誘導起到了對萊菔硫烷引發的細胞凋亡的抵御機制。加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)則顯著增強了細胞死亡，說明，萊菔硫烷誘導的自噬作用在自噬體中隔絕線粒體，導致細胞色素c釋放延遲并激活內在的caspase級聯[7]。類似地，LNCaP細胞可以依靠自噬途徑在雄激素缺乏的條件下生存[8]。另一方面，cysmethynil(一種新化合物可以抑制前列腺腫瘤生長)抑制mTOR信號，在PC3型前列腺癌細胞中優先提高了細胞自噬性死亡(非細胞凋亡)，并且在前列腺癌細胞異種移植的鼠模型中抑制了腫瘤的生長。

在LNCaP型前列腺癌細胞中電離輻射誘導發生自噬性細胞死亡。這一現象實際上取決于受照射細胞的基因表型。例如PTEN，一種抑制侵略性前列腺癌的抗癌基因，可能參與自噬性反應。5 Gy照射后在前列腺癌PTEN-/-PC3型細胞株中誘導自噬，而在PTEN+/+DU145中則沒有。但在PC3和DU145癌細胞株中，不增加磷酸化AKT、磷酸化mTOR和磷酸化S6的水平。值得注意的現象是在兩種細胞中mTOR途徑都保持不變，但是放射后自噬過程只在PC3細胞系中發生。用RAD001抑制mTOR途徑上調自噬，同時增強了PTEN-/-PC3和PTEN+/+DU145兩種細胞對放射的敏感性。此外，通過siRNA干擾ATG5和beclin1基因下調自噬反應，導致PTEN-/-PC3以及PTEN+/+ DU145兩種細胞放射敏感性下降。用致敏劑如小白菊內酯(parthenolide)提高前列腺癌細胞對放射毒性反應僅發生在PTEN存在的情況下。說明對放射敏感性的選擇性存在與自噬過程相關。這也表明，調控自噬作用可能對前列腺癌細胞的放射增敏和抗放射性亞群有特殊的價值。

2.2 自噬與結腸癌細胞通過Schonewolf等[9]的研究可以證實在HT-29和HCT116結腸癌細胞中，輻射可以誘導自噬反應。TEM表明在HT-29細胞系中，用8 Gy劑量照射細胞，與沒有經過照射的對照組相比，24 h后可以觀察到自噬反應發生，并且在照射組中自噬體形成增多。自噬是一種進化上保守的自我消化過程，細胞內的蛋白質和胞質內物質可以循環利用支持細胞在壓力條件下生存。而通過自噬抑制劑氯喹(CQ)則可以增強結腸癌細胞系的放射敏感性，氯喹可以通過改變溶酶體的PH值抑制自噬反應的終末階段，使自噬失去功能作用無法處理蛋白[10]。在Schonewolf等[9]的實驗中，LC-Ⅱ水平的增高可以確認氯喹在HT-29細胞系中有效的抑制了放射誘導的自噬反應，并且因此可以認為這些細胞的放射增敏作用可以歸結為氯喹介導的自噬抑制。上述研究中，氯喹介導的放射增敏作用僅發生在HT-29(p53基因突變型)細胞系中，在HCT-116(p53基因野生型)細胞戲中并沒有作用。當然這些細胞系不能單純僅在p53基因基礎上進行比較，他們在放射增敏上表現的不同還需要進一步研究[9]。

2.3 自噬與食管鱗狀細胞癌細胞根據Chen等[11]的實驗研究，抑制自噬反應有助于食管鱗狀細胞癌的放射增敏作用。自噬反應可以經常在經受過放射治療的癌細胞中出現，3-MA可以抑制三磷酸肌醇3-激酶(PΙ3K)，被廣泛地作為自噬抑制劑應用[12]。在Chen等[11]的實驗中，在經過照射的食管鱗狀細胞癌TE-1細胞系中，用3-MA抑制自噬作用，并通過檢測細胞生存力、細胞周期及凋亡等方法評價阻斷自噬反應對癌細胞放射敏感性的影響，應用6 Gy劑量照射后的TE-1食管鱗狀細胞癌細胞系中，產生大量自噬體以及beclin-1和LC3-Ⅱ基因表達明顯上調。與單獨照射組相比，聯合應用3-MA與放射作用于TE-1細胞系，顯著降低了細胞生存力以及自噬基因beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白水平。下調自噬水平增加了放射誘導的細胞凋亡作用以及G2/M期細胞的百分比。實驗結果表明下調自噬作用可以用于增加食管鱗狀細胞癌細胞對放射治療的細胞毒性反應[11]。

Chen等[13]應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于人食管癌細胞系EC9706細胞，通過集落形成測定腫瘤細胞的放射敏感性，此外在腫瘤異種移植的裸鼠模型中，評價3-MA聯合放療的細胞毒性作用。實驗結果證明，輻射可以誘導自噬體在腫瘤細胞中堆積，同時3-MA又可以有效的抑制自噬體的積累。自噬抑制劑聯合放射治療在體內體外實驗中都顯著增強了腫瘤細胞的放射敏感性。并且，抑制自噬同時也增強了凋亡作用減少腫瘤細胞增殖。放療協同抑制自噬可以明顯的減小腫瘤細胞的體積。

2.4 自噬與肺癌細胞放射誘導自噬反應在肺癌細胞系中已有報道，單純照射抗輻射非小細胞肺癌A549并沒有改變細胞存活情況，但是黃連素(Berberine)和放射聯合治療則可引起劑量依賴性(5～10 μmol/L)自噬性細胞死亡和細胞周期阻滯，而在A549細胞系中觀察到的細胞凋亡則占很少的比例。此外，黃連素聯合放射治療增強放射敏感性的治療應用可能性，在路易斯肺癌模型小鼠中已經得到了證實，實驗證明黃連素聯合放療作用導致了自噬性細胞死亡并使腫瘤體積大幅度縮小，而單獨使用放射治療和黃連素只能延遲腫瘤生長。根據李勇等[14]的實驗，聯合應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)下調低氧環境中人肺癌A549細胞的自噬水平，證明A549細胞在低氧環境中細胞保護性自噬增加，抑制自噬可以正確A549細胞的放療敏感性。Albert等[15]證明單純放射治療或者聯合使用ABT-888，在H460肺癌細胞中誘導自噬性細胞死亡達到7.3倍，細胞凋亡達2.8倍。此外，應用ABT-888/照射聯合治療可以在H460肺癌移植瘤中抑制腫瘤生長。在H460肺癌細胞系中，利用siRNAs減弱Bak/Bax凋亡蛋白功能和RAD001抑制mTOR信號，可以誘導自噬和提高放療敏感性[14]。然而僅對細胞進行照射(5 Gy)并沒有改變自噬過程。Kim等[16]發現照射劑量為5 Gy時并沒有增強自噬反應，而在Albert等[14]的實驗中，用更低的劑量3 Gy照射，自噬過程則明顯增強。因為兩個實驗中檢測自噬的方法相同，可以認為放射治療中放射劑量大小對自噬過程的強度具有不同效果，也可能是有組織特異性的。在肺癌H460細胞系中，Caspase-3抑制劑Z-DEVD和mTOR抑制劑RAD001聯合應用，可以通過誘發自噬性死亡增強放射敏感性。然而敲除ATG5和beclin1基因，這兩種重要的自噬相關基因則誘導肺癌細胞對放射治療的抗性[16]。

根據Liu等[17]的研究，抑制miR-191表達的肺癌細胞可以通過調節細胞自噬建立輻射抗性細胞。因此，可以通過改變miR-191的表達調節自噬作用，針對治療低放療敏感性肺癌。在Liu等[17]的實驗中，兩種抗輻射非小細胞肺癌細胞系中自噬相關蛋白如Beclin-1和LC3-Ⅱ表達上調，表明自噬在耐放射細胞系中作用增強。在乳腺癌、肺癌細胞株中的實驗結果完全一致，一致表明通過各種刺激因子上調自噬可以增強放射造成的細胞毒性，如果同時發生細胞凋亡途徑被抑制則進一步提高放射敏感性。

3 討論

在應對輻射對腫瘤細胞產生的外部壓力時，自噬有著兩個作用相反的主要功能。一個是細胞保護功能，抑制這種作用可以增加腫瘤細胞對治療手段的敏感程度；而另一種是細胞毒性功能，它可以直接促進腫瘤細胞死亡[18]。自噬通過清除損傷的線粒體和異常蛋白聚集體產生活性氧在腫瘤起始和癌變的早期階段的一個重要作用抗癌。而且，敲除自噬相關蛋白和基因會引起DNA損傷和促進癌癥發生。然而，一旦這種功能被克服，腫瘤已經形成，腫瘤細胞將會利用自噬對抗放療或者化療產生的細胞殺傷作用，這種生存機制將會促進癌癥進展[19]。放療是一種控制腫瘤生長的重要治療手段，但是腫瘤會建立起適應性反應，使之對治療產生高度抵抗性，具有更強的侵襲性。因此如何提高腫瘤的放療敏感性引起了國內外極大的關注。調節自噬可能是對抗放療抵抗的新的治療靶點。但是，缺乏臨床前期的動物實驗模型用于證明自噬確實具有此功能。在動物模型中抑制自噬相關信號通路證明下調自噬可以起到增強腫瘤放療敏感性的作用對于此方法的臨床實踐有著至關重要的作用。然而，仍有一些問題需要解決，因此，探索一種方法用來區分自噬的兩種功能可以成為當前實驗研究的方向。

通過前人的不懈努力，我們已經可以確認自噬與人類很多疾病都有密切的關聯。同時，很多藥物雖然可以抑制腫瘤細胞中的自噬水平，但是也破壞了正常組織的動態平衡。這就是為何盡管很多相關研究已經完成，還是無法揭示自噬在腫瘤治療中起到的真正作用。

4 總結

腫瘤細胞在應對治療時出現的自噬反應并不總是細胞死亡的跡象，它也可能是一種對抗治療的細胞保護作用。可以推測，自噬在細胞生存和死亡之間起到了平衡的作用，這種細胞特異性高度依賴于致癌基因的表型以及凋亡相關蛋白的表達。通過調節自噬水平，改變腫瘤細胞對放射治療的敏感性，為更加高效的治療疾病提供了新的研究方向。甚至，在腫瘤治療過程中，也可以通過檢測自噬水平預測放療和化療的效果。

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Influence of change in drug-mediated autophagy level on the radiosensitivity of tumor cells.

XU Zhao-nan,WANG Shu-yu,BI Ye,HU Yue,ZHOU Li-jia,ZHANG Ze-bing.Department of Pathology,School of Stomatology,Jilin University, Changchun 130021,Jilin,CHINA

Experimental results demonstrate that radiation-induced autophagy,a major pathway,which is different from apoptosis that leads to cells death,may lead to either death or survival.The role of autophagy in the antitumor effect of radiotherapy and in radiation toxicity is still obscure.A series of research have proved that inducing and blocking autophagy directly interfers with cytotoxicity and effect of radiotherapy.Simultaneous autophagy and apoptosis during radiotherapy seems to enhance the therapeutic effect.This review summarizes the up-to-date findings on the functions of regulating autophagic response of cancer cells to radiotherapy.

Autophagy;Radiotherapy;Ιnduce;Cancer cells;Research;Progress

R730.231

A

1003—6350（2016）13—2165—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.034

2015-10-22)

吉林省科技發展計劃(編號:20150101174JC)

張澤兵。E-mail：645007015@qq.com