人MUC5AC啟動子熒光報告基因的構建與分析

王孝蕓，藍楠，張沄，王星，李國平

(西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川 瀘州 646000)

人MUC5AC啟動子熒光報告基因的構建與分析

王孝蕓，藍楠，張沄，王星，李國平

(西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川 瀘州 646000)

目的 構建人MUC5AC啟動子熒光報告基因并進行分析。方法 PCR技術克隆人MUC5AC啟動子[(-1 300)～(+48)bp]長度片段的基因，將純化的PCR產物與T載體連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并利用酶切和測序進行重組質粒鑒定；將該重組質粒克隆至pGL3-ehancer熒光報告基因載體上，用脂質體轉染法將熒光報告基因轉染至人支氣管上皮細胞(16HBE細胞)，分別用1 ng/mL的重組細胞因子IL-4和IL-13刺激細胞24 h，并設不做任何處理的對照組；用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性(Rlus1/Rlus2)。結果 人MUC5AC啟動子熒光報告基因構建成功，IL-4和IL-13刺激組的相對熒光素酶活性均高于對照組[IL-4(21.666 7±2.081 67)，IL-13(26.567 8±1.527 53)，對照組(8.33±1.527 53)；F=89.815，P= 0.000]。結論 MUC5AC啟動子核心區域為(-1 300)～(+48)bp范圍，IL-4和IL-13可作用于該區域并促進MUC5AC高表達。

MUC5AC；啟動子；熒光報告基因；IL-4；IL-13

氣道黏液高分泌是哮喘的一大特征。黏蛋白是黏液中的主要成分，是一種糖基化蛋白，其編碼基因為MUC。MUC5AC是氣道表達最多的一種蛋白，在氣道杯狀細胞中高表達，是黏液增生和化生的標志[1-2]。IL-4和IL-13均屬于TH2型細胞因子，促進哮喘的發生和發展，對氣道黏液高分泌有重要調節作用。氣道黏液高分泌存在多種作用機理，如IL-13/IL-4R信號途徑和表皮因子受體(EGFR)途徑等[3-4]，而具體調控機制還有待深入研究。

本研究旨在通過序列分析，構建人MUC5AC啟動子[(-1 300)～(+48)bp]長度片段的熒光報告基因，將該基因轉染至16HBE細胞，并分別用IL-4和IL-13刺激，然后采用Promega雙熒光報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性，從而確定MUC5AC啟動子核心區域，為今后進一步研究其功能和相關轉錄因子的結合位點及調控打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 限制性內切酶(美國MBI公司)；T4DNA連接酶，dNTP，Taq酶及buffer(中國Takra公司)；質粒小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒(美國Omega公司)；質粒大量提取試劑盒(中國Beyotime公司)；動物細胞基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker(中國YRBIO公司)；人重組細胞因子IL-4、IL-13 (美國Peprotech公司)；脂質體2000(美國Invitrogen公司)；pMD19-TS載體，pRl-TK質粒，pGL3-enhancer (中國百替公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；16HBE細胞，大腸桿菌DH5α感受態細胞(本實驗室保存)。

1.2 方法

1.2.1 hMUC5AC/-1 300/+48啟動子序列調取

1.2.1.1 A549細胞基因組DNA提取 收集(1× 106)～(1×107)個A549細胞，使用YRBIO動物細胞基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。電泳檢測提取的基因組DNA質量。

1.2.1.2 PCR擴增MUC5AC基因-1300/+48位啟動序列 通過NCBI基因數據庫找到MUC5AC基因序列，根據資料確定啟動子區域(-1300/+48)[5]，并通過UCSC軟件找到該啟動子區域。用Primer Premier 5.0設計擴增-1 300/+48啟動子的引物，并分別在上下游引入Knp和XhoⅠ酶切位點。引物序列如下：hMUC5AC(-1 300/+48)上游：CGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC；hMUC5AC(-1300/+48)下游：CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA。用高保真Taq酶進行PCR擴增。反應體系：10×PCR buffer：5 μL；10 μmol/L dNTP：2 μL；10 μmol/L上游引物：0.5 μL；10 μmol/L下游引物：0.5 μL；基因組DNA：0.5 μL；Taq酶：0.5 μL；ddH2O：41 μL；共計：50 μL。PCR反應程序：94℃預變性：5 min；94℃變性：30 s；58℃退火：30 s；72℃延伸：80 s；變性-退火-延伸三步驟重復循環35次，最后72℃延伸。

1.2.1.3 PCR產物的純化 將PCR擴增產物進行核酸水平電泳，凝膠濃度為1%。電泳30 min后將膠切下用以回收目的基因條帶。

1.2.1.4 PCR產物連接T載體 反應體系：MUC5AC/-1300/+48 PCR產物：7 μL；pMD19-TS載體：1 μL；10×緩沖液：1.5 μL；T4DNA連接酶：1 μL；ddH2O：4.5 μL；共計：15 μL。反應條件：將反應體系于1.5 mL EP管中輕微混勻，再將該EP管置于低溫恒溫水浴箱，于16℃下進行連接反應，反應時間過夜，次日混合液直接用于轉化。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。

1.2.1.5 重組質粒的鑒定 用KpnⅠ和XhoⅠ做雙酶切鑒定，酶切產物凝膠水平電泳，用凝膠成像儀檢測DNA片段大小，同時將鑒定的陽性菌種送公司測序。

1.2.2 pGL3-hMUC5AC/-1300/+48克隆

1.2.2.1 雙酶切中間載體和克隆載體 酶切反應體系：①pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48：20 μL；10× buffer：4 μL；10×BSA：4 μL；KpnⅠ：1 μL；Xho I：1 μL；ddH2O：10 μL；共計：40 μL。②pGL3-enhancer：20 μL；10×buffer：4 μL；10×BSA：4 μL；KpnⅠ：1 μL；Xho I：1 μL；ddH2O：10 μL；共計：40 μL。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測載體是否切開。酶切反應徹底后，用DNA片段快速純化/回收試劑盒回收pGL3-enhancer載體及MUC5AC/-1300/+48條帶。

1.2.2.2 連接反應 連接反應體系體積15μL：MUC5AC/-1 300/+48酶切產物：7 μL；pGL3-enhancer酶切產物：1 μL；10×buffer：1.5 μL；T4DNA連接酶：1 μL；ddH2O：4.5 μL。反應條件同前述連接反應。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，操作步驟如前述轉化步驟。

1.2.2.3 重組質粒鑒定 重組質粒鑒定的方法同hMUC5AC/-1300/+48啟動子序列調取時重組質粒鑒定。

1.2.3 人MUC5AC啟動子熒光報告基因檢測

1.2.3.1 質粒大提 碧云天質粒大提試劑盒大提pGL3-hMUC5AC/-1300/+48質粒和pRL-TK質粒：用Bio-Tech核酸定量儀測定相應的DNA濃度。

1.2.3.2 pGL3-hMUC5AC/-1300/+48和pRL-TK質粒共轉染16HBE細胞 用不含抗生素的高糖DMEM培養基在24孔板內培養16HBE細胞，培養條件為37℃，5%CO2。等細胞融合度為80%～90%時，用Invitrogen脂質體2000試劑盒進行質粒轉染，37℃培養。轉染4 h后換含血清的新鮮DMEM培養基。

1.2.3.3 IL-4和IL-13刺激16HBE及熒光報告基因檢測 將上述轉染細胞換不含血清和抗生素的DMEM培養基培養過夜。分別用濃度為1 ng/mL的IL-4和IL-13刺激細胞24 h，每種刺激物各設3個復孔，并設不做任何處理的細胞作為空白對照。24 h后，用Promega雙熒光報告基因檢測試劑盒檢測報告基因的表達，記錄相對熒光素酶活性Rlus1/Rlus2。

1.3 統計學方法 應用統計學軟件SPSS17.0處理實驗數據，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析法分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 A549細胞基因組DNA提取 電泳檢測提取的A549細胞基因組DNA，質量較好，效果如圖1。

圖1 電泳檢測提取的A549細胞基因組DNA注：M，2 kb plusⅡ；1，基因組DNA。

2.2 MUC5AC/-1300/+48啟動子擴增 PCR產物經電泳檢測，擴增到約1 340 bp的條帶，與預期結果相符，見圖2。

圖2 MUC5AC/-1 300/+48 PCR擴增結果注：M，D2000；1，PCR結果。

2.3 pMD19-TS-MUC5AC/-1 300/+48載體鑒定 將MUC5AC/-1 300/+48片段亞克隆至pMD19-TS載體，陽性克隆經Knp I和Xho I雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1 300/+48片段條帶和約2.7 kb的載體條帶，見圖3。

圖3 pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48酶切鑒定注：M，2 kb plusⅡ；1，pMD19-TS-MUC5AC/-1 300/+48酶切片段。

2.4 pGL3-MUC5AC/-1 300/+48載體鑒定 將pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48亞克隆pGL3-enhance載體，陽性克隆經KnpⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1 300/+48片段條帶和約5.0 kb的載體條帶，見圖4。

圖4 pGL3-MUC5AC/-1 300/+48酶切鑒定注：M，2 kb plusⅡ；1，pGL3-MUC5AC/-1 300/+48酶切片段。

2.5 相對熒光素酶活性檢測 將構建的重組報告基因轉染16HBE細胞，分別用IL-4和IL-13刺激細胞24 h，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明：IL-4和IL-13刺激組的相對熒光素酶活性均高于對照組[IL-4 (21.666 7±2.081 67)，IL-13(26.567 8±1.527 53)，對照組(8.33±1.527 53)；F=89.815，P=0.000＜0.05]，見圖5。

圖5 人MUC5AC啟動子熒光報告基因檢測

3 討論

哮喘是當前世界面臨的重要健康問題。氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，在重癥哮喘發作時尤其明顯。如何抑制氣道黏液高分泌成為哮喘防治需解決的關鍵問題[6]。MUC5AC是一種黏蛋白，編碼基因為MUC。已有研究表明，MUC5AC在氣道中表達最多，對氣道黏液高分泌有重要作用[2]，因此對MUC5AC作用機理的研究對于哮喘的防治具有重要意義。

基因表達的調節是研究細胞組織功能的分子基礎，尤其是基因轉錄水平的調控對于基因表達是一種最有效的調節方式[7]。轉錄水平調控是真核基因表達調控的重要環節。研究表明MUC5AC表達的增加主要依賴于MUC5AC基因的轉錄實現。MUC5AC的啟動子區域有特異性蛋白1(Sp1)和NF-κB等轉錄因子結合位點[8-9]。這些轉錄因子蛋白的表達可促進MUC5AC啟動子的活化，誘導MUC5AC基因轉錄，從而促使MUC5AC黏蛋白的高表達。因此在MUC5AC啟動子區域做哮喘相關轉錄因子的進一步探索對于哮喘黏液高分泌的作用機制研究具有重要作用。在本次研究中，筆者首先通過NCBI基因數據庫找到MUC5AC基因序列，確定MUC5AC的啟動子區域(-1 300/+48)，并通過UCSC軟件找到該啟動子區域。用Premier 5.0設計擴增-1300/+48啟動子的引物，通過基因重組及PCR技術，構建了人MUC5AC啟動子熒光報告基因，為后續哮喘相關轉錄因子結合位點的尋找打下基礎。

IL-4和IL-13屬于Th2細胞因子，對哮喘的發生和發展有促進作用，二者均通過IL-4Rα傳遞信號。IL-4Rα是一種受體復合物，分為兩類：Ⅰ型(IL-4Rα和γc)及Ⅱ型(IL-4Rα和IL-13Rα1)。IL-4和IL-13共享Ⅱ型受體。IL-4R途徑與STAT6活化有關。磷酸化的STAT6二聚體向核遷移并與IL-4和IL-13啟動子結合，由此影響Th2細胞分化，氣道高反應和氣道黏液高分泌[10]。Douglas等[11]研究表明，變應原誘導的氣道黏液高分泌與Clara細胞中的IL-4Rα信號途徑密切相關。當Clara細胞缺失IL-4Rα時，小鼠黏液基因的表達和上皮細胞中黏液的含量都顯著減少。關于IL-13，或其相似因子如IL-4等介導的氣道黏液高分泌的研究報道很多，但結果都不盡相同。有的研究報道它們對黏液產生沒有影響；有的報道這些細胞因子會減少黏液產生和黏蛋白表達[12]。Atherton等[13]研究報道只有在低濃度(1 ng/mL)，而不是高濃度(10 ng/mL)時，細胞因子才能增加黏液產生。本研究采用濃度為1 ng/mL的重組人IL-4和IL-13細胞因子，分別刺激轉染了人MUC5AC啟動子熒光報告基因的16HBE細胞，用雙熒光報告基因檢測法進行檢測，結果顯示IL-4和IL-13刺激組的相對熒光素酶活性要高于對照組的相對熒光素酶活性，證明人MUC5AC啟動子熒光報告基因構建成功，且表明IL-4和IL-13在MUC5AC啟動子區域有作用位點，具體作用機理還有待進一步研究。

本研究通過基因重組技術成功構建了人MUC5AC啟動子熒光素酶報告基因，并用細胞因子IL-4和IL-13對其進行活性分析，為以后在MUC5AC啟動子區域內研究哮喘相關轉錄因子奠定基礎，對闡明哮喘氣道高分泌作用機理具有重要作用。

[1]Thai P,Loukoianov A,Wachi S,et al.Regulation of airway mucin gene expression[J].Annu Rev Physiol,2008,70:405-429.

[2] Reid CJ,Gould S,Harris A.Developmental expression of mucin genes in the human respiratory tract[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,17(5):592-598.

[3]Oh CK,Geba GP,Molfino N.Investigational therapeutics targeting the IL-4/IL-13/STAT-6 pathway for the treatment of asthma[J].Eur Respir Rev,2010,19(115):46-54.

[4]Liu Z,Tian F,Feng X,et al.LPS increases MUC5AC by TACE/ TGF-alpha/EGFR pathway in human intrahepatic biliary epithelial cell[J].Biomed Res Int,2013,2013:165715.

[5]Jonckheere N,Van Der Sluis M,Velqhe A,et al.Transcriptional activation of the murine Muc5ac mucin gene in epithelial cancer cells by TGF-beta/Smad4 signalling pathway is potentiated by Sp1[J].Biochem J,2004,377(Pt 3):797-808.

[6]Hewson CA,Haas JJ,Bartlett NW,et al.Rhinovirus induces MUC5AC in a human infection model and in vitro via NF-kappaB and EGFR pathways[J].Eur Respir J,2010,36(6):1425-1435.

[7]Kadam S,Emerson BM.Mechanisms of chromatin assembly and transcription[J].Curr Opin Cell Biol,2002,14(3):262-268.

[8]Hewson CA,Edbrooke MR,Johnston SL.PMA induces the MUC5AC respiratory mucin in human bronchial epithelial cells,via PKC,EGF/ TGF-alpha,Ras/Raf,MEK,ERK and Sp1-dependent mechanisms [J].J Mol Biol,2004,344(3):683-695.

[9]李升錦,周向東.人MUC5AC基因啟動子熒光素酶報告基因載體的構建及其轉錄活性分析[J].中南大學學報:醫學版,2010,35(8): 792-799.

[10]Dasgupta P,Chapoval SP,Smith EP,et al.Transfer of in vivo primed transgenic T cells supports allergic lung inflammation and FIZZ1 and Ym1 production in an IL-4Ralpha and STAT6 dependent manner[J]. BMC Immunol,2011,12(2):429-436.

[11]Kuperman DA,Huang X,Nguyenvu L,et al.IL-4 receptor signaling in Clara cells is required for allergen-induced mucus production[J].J Immunol,2005,175(6):3746-3752.

[12]Jayawickreme SP,Gray T,Nettesheim P,et al.Regulation of 15-lipoxygenase expression and mucus secretion by IL-4 in human bronchial epithelial cells[J].Am J Physiol,1999,276(4 Pt 1):596-603.

[13]Atherton HC,Jones G,Danahay H.IL-13-induced changes in the goblet cell density of human bronchial epithelial cell cultures:MAP kinase and phosphatidylinositol 3-kinase regulation[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,285(3):730-739.

Construction and analysis of the luciferase reporter gene of human MUC5AC promoter.

WANG Xiao-yun,LAN Nan,ZHANG Yun,WANG Xing,LI Guo-ping.Inflammation&Allergy laboratory,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

Objective To construct and analyze the luciferase reporter gene of human MUC5AC promoter. Methods Fragment of human MUC5AC promoter[(-1 300)～(+48)bp]was cloned by PCR technology.Purified product of PCR was connected with T vector.The connection product was transformed into Escherichia coli DH5α competent cells and identified by enzyme digestion and sequencing.The recombinant plasmid was cloned into luciferase reporter vector of pGL3-ehancer and transfected into 16HBE cells.Then recombinant cytokines of IL-4 and IL-13 were respectively used to stimulate cells at concentration of 1 ng/mL for 24 hours.Meanwhile,cells without any stimulation were used as control.After 24 hours,cells were tested for relative luciferase activity(Rlus1/Rlus2)by dual luciferase reporter gene detection kit of Promega.Results Human MUC5AC promoter was constructed successfully.Relative luciferase activity(Rlus1/Rlus2)of cells with stimulation of IL-4 and IL-13 was higher than that of control cells[IL-4 (21.666 7±2.081 67),IL-13(26.567 8±1.527 53),(8.33±1.527 53);F=89.815，P=0.000].Conclusion The core region of MUC5AC promoter is in(-1 300)～(+48)bp section.IL-4 and IL-13 have function in such region and promote expression of MUC5AC.

MUC5AC;Promoter;Luciferase reporter gene;IL-4;IL-13

R394

A

1003—6350（2016）15—2409—04

2016-03-11)

國家自然科學基金（編號：81170032）

李國平。E-mail：lzlgp@163.com