應用形態學及動力學參數篩選優質囊胚的研究進展

魏明明，何玉潔

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·綜述·

應用形態學及動力學參數篩選優質囊胚的研究進展

魏明明，何玉潔△

囊胚的質量在選擇性單囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）中至關重要，移植1個優質的囊胚，可以有效降低多胎率并保持較高的臨床妊娠率。目前，囊胚質量的評價方法仍以形態學為主。傳統的形態學評分法對各形態學參數進行綜合評分，得分高的囊胚質量較優。但當有2個以上綜合評分相同的囊胚可供移植時，需要新的指標來選擇出最具有發育潛力者。研究顯示，囊胚的3個相互獨立的形態學參數：內細胞團（inner cellmass，ICM）、滋養層（trophectoderm，TE）和囊胚擴張程度三者對妊娠結局的預測價值不同，可以為囊胚的進一步篩選提供參考。近年來，應用延時（time-lapse）成像技術可以動態觀察胚胎發育的全過程，原核期、卵裂期以及囊胚期的動力學參數成為了囊胚質量評價的新指標。綜述應用形態學及動力學參數篩選優質囊胚的研究進展。

受精，體外；胚胎移植；囊胚；形態發生；動力學

【Abstract】The blastocyst quality is very important for the elective single blastocyst transfer（eSBT）.The multiple pregnancy rate can be effectively reduced，and the clinical pregnancy rate can be kept at a higher level，by transplanting a high-quality blastocyst.At present，the main method to evaluate the quality of blastocysts is morphology.The morphological parameters were comprehensively scored by the traditionalmorphological scoring method，which means that the blastocystwith higher score is of the better quality.However，when there aremore than two blastocysts with the same score，new indicators are necessary for embryologists to select the blastocyst with the most developmental potential for transplantation.Three independent morphological parameters of blastocyst，inner cell mass（ICM），trophectoderm（TE）and degree of blastocyst expansion with the different predictive value for the pregnancy outcomes，can provide additional references for the further screening of the blastocyst.In recent years，the whole process of embryonic development can be observed dynamically by timelapse imaging technology.The kinetic parameters of pronuclear stage，cleavage stage and blastocyst stage were tried as the new index for evaluating the quality of embryo.In this article，we reviewed the research progress on the screening high quality blastocyst bymorphological and kinetic parameters.

【Keywords】Fertilization in vitro；Embryo transfer；Blastula；Morphogenesis；Kinetics

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：308-312）

隨著輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）日漸成熟，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的胚胎移植率、著床率、妊娠率均有明顯的提高。由于囊胚比卵裂期胚胎更加符合妊娠生理，因此有更好的妊娠結局［1］。為避免導致多胎妊娠，臨床工作者逐漸認可選擇性單囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）［2］。在eSBT中，囊胚質量關系到妊娠結局，所以如何有效評價囊胚質量，選擇一個優質囊胚進行移植，變得尤為重要。目前囊胚的評價方法包括形態學、代謝組學、基因組學，目前常用的是Gardner等［3］提出的囊胚標準形態學評分方法。由于可選擇囊胚數量的增加，各個獨立的形態參數對臨床妊娠的重要性也逐漸引起輔助生殖領域的重視。并且，早期的囊胚標準形態學評分均是在離散時間點對囊胚進行觀察，這限制了選擇最佳胚胎的信息量。而近年興起的延時（time-lapse）成像技術則彌補了這個不足。一些在胚胎發育過程中新的動力學指標有助于胚胎學家更有效地評價胚胎質量，并且在臨床上取得了一定的效果。

作者單位：030001太原，山西醫科大學臨床醫學院（魏明明）；山西醫科大學第一醫院（何玉潔）

通信作者：何玉潔，E-mail：hyj7007@163.com

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審校者

1　形態學參數綜合評分

卵母細胞受精后第5天（D5）有可能發育到囊胚期，細胞間開始形成囊腔，其內充滿液體。形成囊胚后，細胞開始分化，形成滋養層（trophectoderm，TE）細胞和內細胞團（inner cellmass，ICM）細胞兩種不同的細胞成分。由于不同質量的胚胎發育速度不一致，有的胚胎可能在受精后D6、D7甚至更晚才形成囊胚。已有研究證實，較早形成的囊胚發育潛能更佳，移植后可獲得更好的妊娠結局［4-5］。目前，國內外的共識是在受精后D5～D6對囊胚進行篩選及移植。

Dokras等［6］最早提出了一個簡易囊胚評分系統，根據囊胚的發育速度將囊胚分為3級。1級：D5或D6形成的ICM和TE、清晰的擴張囊胚；2級：比1級囊胚發育延遲24～48 h，D6或D7形成與1級囊胚形態相似的胚胎；3級：體外培養5～7 d形成的囊胚發育差、ICM和TE內有退化區域的囊胚。該方法雖然簡單，卻是一個直觀完整的指導囊胚篩選的形態學評分體系，為此后囊胚形態學評分的發展奠定了基礎。

2000年Gardner等［3］提出了一個綜合囊胚擴張程度、ICM和TE發育的形態學評分方法。用1～6的連續數字將囊胚按照擴張程度和孵化狀態進行區分，已經擴張的囊胚，則進一步對ICM和TE進行質量分級，均分成A、B、C三級。并通過實驗證實移植一個高評分的囊胚，可以在保持妊娠率較高的同時降低多胎率。此后，有研究也證實了此囊胚評分方法的有效性［7］。Gardner評分法作為囊胚形態學評分及研究的傳統標準，在國內外廣泛沿用至今。

2　獨立形態學參數

雖然有研究表明2個或2個以上形態學參數得分最高的囊胚進行移植，可以實現最高的植入率［7］。但3個形態學參數具有獨立性，ICM將來發育為胎兒，TE發育為與母體連接的胎盤，囊胚擴張程度也一定程度上體現出胎兒的發育潛能。所以，在eSBT中，當有多個綜合評分相同但獨立形態學參數評分不同的囊胚可供移植時，即當有Gardner綜合評分為4AB（分別代表囊胚擴張程度，ICM和TE）與4BA的囊胚同時存在，給囊胚的選擇帶來了困惑。這些囊胚可能在發育潛能上有一定差異，當選擇最佳囊胚時可以利用這種差異。但Gardner評分法在對囊胚的發育潛能了解上具有局限性，因此要作出這一決定，有必要了解每個形態參數對囊胚植入過程的貢獻。

2.1ICM ICM的研究曾經成為預測囊胚移植成功的關鍵，并且認為ICM是囊胚移植后臨床結局的最好預測因子［8-9］。2001年，Richter等［8］研究發現，囊胚擴張程度和TE數量與種植率無關，培養至D5擁有最佳大小和形狀的ICM的囊胚植入率最高。提示ICM的數量高度顯示囊胚植入潛能，但其研究的重點放在用來定義一個最優的ICM，TE形態只是基于橫斷面的細胞計數，不包括評價TE的大小和形狀，影響到了結果的判斷價值。之后，一項以Gardner評分為基礎的研究，比較了3個獨立形態學參數對妊娠結局的預測作用后提出，只有ICM等級與早期妊娠丟失率顯著相關，該研究認為移植時選擇ICM A級的囊胚可顯著減少早期流產發生，提示了在Gardner評分上ICM預測囊胚能力的重要性［10］。

2.2TE近年更多的研究認為TE評分較ICM更能預測臨床結局。2011年，Ahlstr?m等［11］研究發現，TE細胞形態是預測出生結局最重要的形態學參數。雖然囊胚腔擴張和ICM形態在進行單因素和多因素分析中是顯著的預測因子，但在多元Logistic回歸分析中并不是活產的顯著預測因子。Kovacic等［9］在研究中描述了一個囊胚分級系統，依據囊胚的3個獨立形態學參數將囊胚分為8個形態等級（B1～B8），B1～B8的囊胚移植結果顯示了植入率與出生率的顯著降低。其結論是一個正常的ICM是囊胚植入的最重要參數，但從囊胚B1到B2的分類中，唯一的形態差異是TE的等級差別，這種等級差別導致了活產率降低13%（45.2%vs.32.8%）。同樣，Ahlstr?m等［11］的研究也指出，當TE形態從A下降到B時，活產率下降16% （49.9%vs.33.9%），這說明當一個正常的ICM存在時，TE可影響出生率。此后有研究提出，更好的TE形態、更年輕的患者以及囊胚的進一步培養都可以獲得較高的臨床妊娠率和活產率，但TE形態是最佳囊胚移植的關鍵因素［12］。且有國外學者對1 087個冷凍SBT中3個獨立形態學參數對妊娠結局的預測能力進行研究后發現，僅TE形態與臨床持續妊娠率和流產率有關［13］。有研究對囊胚擴張程度進行限定，將TE 與ICM對妊娠結局的預測能力進行了比較，也認為TE是最重要的預測因子［14］。一項對194個整倍體胚胎和238個非整倍體胚胎的研究發現，TE形態可能與非整倍體有關。相對于好的TE形態，TE形態較差的囊胚非整倍體發生率上升2.5倍，且這種對非整倍體的影響出現在囊胚期而不是卵裂期，凸顯了TE形態在囊胚質量評價中的優勢［15］。

2.3囊胚擴張程度2013年，Thompson等［12］對3 151例新鮮SBT進行了回顧性分析發現，除TE形態是最佳囊胚移植的關鍵因素外，囊胚擴張程度也可在一定程度上預測出生結局。但有研究結果顯示，囊胚擴張程度對妊娠結局無顯著的預測價值［11，13］。由于解凍周期過程比新鮮周期過程更復雜，針對此過程是否會對囊胚產生影響，Ahlstr?m等［16］對預凍和解凍后囊胚的重新擴張程度進行了研究，認為預凍囊胚擴張程度、TE等級和重新擴張程度是解凍后囊胚移植出生率的最重要預測因素。但解凍后囊胚重新擴張程度是否對妊娠結局具有預測作用，由于研究較少，目前無比較的價值，這也是未來囊胚形態學研究關注的重點。

許多IVF實驗室沒有適當的證據，ICM一直被認為是最重要的預測妊娠/生育的因素［8-10］，主要理由是ICM細胞可以引起胎兒生長。然而，近年的研究表明，在囊胚移植過程中，TE對臨床結局的預測價值更加顯著，如果沒有一個功能性TE建立的著床，ICM在母體內的發展就很難發生［11-16］。所以，在eSET中，當有綜合評分為4AB和4BA的囊胚可供選擇時，應該優先選擇4BA的囊胚進行移植。而囊胚擴張程度是否具有預測價值，仍在不斷探索中。

3動力學參數

胚胎早期發育主要經歷原核期、卵裂期及囊胚期三個連續的過程。囊胚標準形態學評分在靜態觀察下對囊胚進行篩選，一定程度上限制了對優質囊胚的判斷。近年來，延時（time-lapse）成像技術逐漸應用于胚胎培養并得到不斷改進［17］，最新的延時成像技術已可以在盡量減少對胚胎影響的同時，動態地觀察胚胎早期發育的全過程。動物模型研究提示：植入前胚胎的行為特點是反映囊胚形成能力、囊胚質量以及妊娠結局的一個重要依據［18-19］。隨著該項技術在臨床的推廣應用，越來越多的研究期望從中找出具有預測囊胚質量以及妊娠結局價值的動力學指標，以彌補現有囊胚形態評分的不足。

3.1原核期、卵裂期動力學參數2008年，Lemmen等［20］報道了采用延時成像技術觀察胚胎由受精卵到卵裂期的相關動力學參數的研究，認為原核消失時間早的胚胎發育潛能更好。此后，有研究用延時成像觀察了受精后14～15 h、16～18 h、19～20 h這3個時間段內原核核仁前體分布情況的動態變化，發現在3個時間間隔的核仁分布發生著不斷改變，認為常規19～20 h靜態觀察，可能造成對胚胎質量的誤判，實時動態觀察法更為可靠，可以獲得更多對胚胎篩選有價值的觀測指標［21］。

2010年，Wong等［22］的研究指出，胚胎前3次分裂的時間能夠準確地預測囊胚形成的能力，提示了囊胚的形成與卵裂期動力學參數有關；2012年，Hlinka等［23］的研究中，連續觀察胚胎裂解到16-細胞階段，提出能夠成功妊娠的囊胚在前期的培養中有一致的卵裂模式和間隔；有研究對延時成像中觀察到的動力學參數進行了比較，結果顯示從2-細胞到8-細胞分裂的同步性是預測囊胚形成和質量的最佳指標［24］；Hashimoto等［25］將形態學綜合評分與動力學參數相結合，比較了囊胚質量與完成第2次及第3次有絲分裂所需時間，結果顯示評分高的囊胚比評分低的囊胚完成2次分裂所需的時間短；Cruz等［26］的研究也指出，囊胚的形態學參數與前期胚胎發育的動力學參數有關，卵裂期胚胎的動力學參數影響囊胚質量的評價。另有研究表明卵裂期細胞碎片也一定程度上影響了囊胚的質量和妊娠結局［27］。

隨著越來越多與胚胎質量和妊娠結局相關的動力學參數的發現，有學者建立了一個基于延時成像動力學參數預測囊胚發育的多因素回歸模型，模型中納入的動力學參數包括由受精開始到胚胎分裂成2，3，4和5卵裂球的連續的時間過程，以及每一個過程之間的時間間隔，結果顯示發育到囊胚的各胚胎預測參數的大小與沒有發育到囊胚階段相比有顯著差異［28］。最近Milewski等［29］建立了一個預測囊胚移植后妊娠結局的動力學參數回歸模型，結果發現植入組與非植入組的參數差異顯著。以上模型的建立，體現了動力學參數包含的信息對囊胚質量及妊娠結局的重要價值，可以為優質囊胚的篩選提供更多的幫助。

3.2囊胚期動力學參數近年隨著胚胎培養技術及延時成像技術的不斷成熟，逐漸發現了不易觀察到的囊胚期動力學參數。研究者開始嘗試將這些參數納入預測囊胚發育潛能及妊娠結局的模型中，探尋更加全面的胚胎篩選方式。Motato等［30］建立了一個預測囊胚形成及植入的動力學參數回歸模型，結果顯示囊胚擴張時間可以預測囊胚植入。另有研究顯示，囊胚擴張時間是囊胚質量的最佳預測參數，并提出篩選優質囊胚的動力學參數模型應包含囊胚擴張時間［31］。

在囊胚期的觀察中，會發現部分囊胚的囊腔收縮（皺縮），持續時間通常不超過1 h。傳統靜態觀察方式通常是在囊胚再擴張后進行評價，忽略了這一時期的動力學改變。而早期已有研究對小鼠囊胚的收縮進行延時觀察并發現，囊胚在形成10 h后有不同程度的重復收縮，弱的收縮（體積減少＜20%）有利于囊胚孵化，而強大的收縮（體積減少≥20%）抑制孵化，提示了囊胚的收縮可能對胚胎的發育能力產生影響［32］。Marcos等［33］應用延時成像觀察了囊胚的崩潰（強烈收縮）過程（囊胚滋養層細胞表面自透明帶分離≥50%）及胚胎種植率，結果顯示崩潰的囊胚相比于無崩潰的囊胚植入率顯著降低（35%vs. 48.5%），認為囊胚崩潰模式可以作為囊胚篩選的額外標準。但近期有學者對囊胚崩潰與出生率的相關性進行了多因素分析后發現，囊胚崩潰不是顯著的預測因素，提出囊胚崩潰模式不應單獨作為生殖預后的預測因素，應與預測生殖結局的其他動力學變量協同考慮［34］。

有研究指出：無論是通過靜態或動態觀測，囊胚培養應用的增加，可能放緩基于胚胎發育早期階段質量評價指標的研究［35］。因此，隨著目前可移植囊胚數量的增加，囊胚培養階段的動力學參數將是未來研究的重點，也將為優質囊胚的篩選提供更多的參考。

4結語

綜上所述，在囊胚質量的評價上，形態學仍是一個不可忽略的重要方法。eSBT中，優質囊胚的選擇應從形態學評價開始。通過進一步的前瞻性研究，與獨立形態參數對預測妊娠結局的重要性上達成統一，為進一步的篩選提供幫助。2011年歐洲人類生殖與胚胎學會（ESHRE）對卵母細胞和胚胎形態學評價進行了總結，為確定植入潛力最高的胚胎，提出了一種以形態學為基礎，聯合延時成像分析新參數的胚胎質量評價模式［36］。這種模式在囊胚質量的評價上結合了形態學和動力學參數后更加完善，但要逐漸應用于臨床還需進一步的研究。

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［本文編輯秦娟］

Screening High Quality Blastocyst by M orphological and K inetic Parameters

WEIMing-ming，HE Yu-jie. Clinical Medicine College of ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China（WEIMing-ming）；First Hospital of ShanxiMedical University，Tiayuan 030001，China（HE Yu-jie）

HE Yu-jie，E-mail：hyj7007@163.com

（2016-03-23）