典型生境中氨氧化古菌和厭氧氨氧化細菌的分布和豐度*

徐相龍 陳祥春 劉國華# 范 強 王 皓 任爭光 齊 魯 王洪臣

(1.中國人民大學環境學院，北京 100872；2.濟南熱力有限公司，山東 濟南 250100)

典型生境中氨氧化古菌和厭氧氨氧化細菌的分布和豐度*

徐相龍1陳祥春2劉國華1#范 強1王 皓1任爭光1齊 魯1王洪臣1

(1.中國人民大學環境學院，北京 100872；2.濟南熱力有限公司，山東 濟南 250100)

運用分子生物學方法研究了某富營養化湖泊污泥(以下簡稱湖泊污泥)、某長期施肥的稻田土壤(以下簡稱稻田土壤)和某污水處理廠硝化污泥(以下簡稱硝化污泥)中氨氧化古菌(AOA)和厭氧氨氧化(ANAMMOX) 細菌的分布及豐度。結果表明，湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中AOA的amoA基因Shannon指數分別為1.64、2.14、0.57，稻田土壤的生物多樣性最豐富；但以上3種生境中AOA的amoA基因豐度分別為(1.45±0.13)×107、(7.24±0.25)×105、(3.46±0.22)×105拷貝數/g(以干質量計，下同)，湖泊污泥中最大。湖泊污泥和稻田土壤中的AOA與水/沉積物中的古菌親緣關系相近，既有來自水/沉積物分支，又有來自土壤/沉積物分支；硝化污泥中的AOA與土壤/沉積物中的古菌親緣關系相近，全部來自土壤/沉積物分支。湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因Shannon指數都較小，生物多樣性不豐富，但hzsB基因的豐度分別達到(1.32±0.17)×108、(2.88±0.28)×108、(7.76±0.25)×108拷貝數/g。湖泊污泥、稻田土壤中ANAMMOX細菌的優勢種屬于Brocadia屬；硝化污泥中ANAMMOX細菌的Brocadia和Kuenenia幾乎各占一半。

氨氧化古菌 厭氧氨氧化細菌 生物多樣性 基因豐度

AOA和ANAMMOX細菌是環境科學領域新的重大發現[8]，使人們重新認識全球氮循環過程。富營養化湖泊的污泥、長期施肥的土壤以及污水處理廠污泥中均含有高濃度的氮素，尤其是氨氮，是氮轉化微生物的典型生境，了解這些典型生境中氮轉化微生物類別及其特征對氮污染的治理具有重要的指導意義。本研究選擇了某富營養化湖泊的岸邊濕地帶污泥、某含高濃度氮素的稻田土壤和某污水處理廠污泥3個典型生境，對其中的AOA和ANAMMOX細菌分布和豐度進行了研究，旨在為厭氧生物脫氮系統的構建提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

富營養化湖泊污泥(以下簡稱湖泊污泥)取自河北省安新縣某富營養化湖泊的3個島上，采樣點為距離水陸交界線1 m處的岸邊濕地帶，3個采樣點采集的污泥均勻混合后置于無菌袋中密封。長期施肥的稻田土壤(以下簡稱稻田土壤)取自上海市松江區某稻田，多點采集0～50 cm的表層土壤，均勻混合置于無菌袋中密封。污水處理廠硝化污泥(以下簡稱硝化污泥)取自北京市某污水處理廠的曝氣池，采集后置于無菌袋中密封。上述樣品在4 ℃條件下送至實驗室，于-80 ℃冷凍保存直至DNA提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取與擴增

使用Qbiogene土壤DNA快速提取試劑盒對3種典型生境中的樣品進行DNA提取。AOA采用聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增，引物為AOA特異性引物Arch-amoAF和Arch-amoAR[9]14684。AMMOXOX細菌采用巢式PCR進行擴增，第1輪采用浮霉菌通用引物PLA46f/630r[10-11]，第2輪采用ANAMMOX細菌特異性引物Amx368f和Amx820r[12]。

1.2.2 系統發育樹與生物多樣性

擴增產物與pGEM?-T Easy載體進行連接，連接產物轉化至Trans1-T1感受態細胞，用含有Amp、IPTG和X-Gal的LB平板于37 ℃下過夜培養，進行藍白斑篩選。每個平板樣品隨機選取72個白色克隆，經陽性鑒定后取35個陽性克隆子進行測序，運用DOTUR軟件按3%的差異度對amoA基因和16S rRNA基因去除載體序列，得到獨立操作分類單元(OTU)。每個OTU中選取代表性序列通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫進行在線BLAST比對，并與AOA的amoA序列和ANAMMOX細菌的16S rRNA序列進行多重比對，采用MEGA 5.0軟件的鄰接法構建系統發育樹[13]。用Shannon指數計算生物多樣性。

1.2.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR采用SYBY Green法，AOA定量PCR引物與1.2.1節相同，ANAMMOX細菌定量PCR引物使用hzsB基因引物AmxF和AmxR[14]。引物擴增體系為20 μL，其中SYBY Green mix 10 μL，引物(摩爾濃度為5 μmol/L)各0.4 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補足至20 μL。AOA的反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸45 s，共進行40個循環。ANAMMOX細菌的反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環。同時設置陰性對照和7個濃度梯度的標準品，每個樣品(包括陰性對照和標準品)設置兩次平行，以10倍基線熒光信號的標準偏差作為閾值，得到標準曲線與CT值。要求擴增斜率為-4.2～-3.5，擴增效率>95%，溶解曲線為單峰。

2 結果與討論

2.1 不同生境中AOA的分布和豐度

2.1.1 不同生境中AOA的系統發育樹分布

湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中AOA的amoA基因分別得到7、14、2個OTU，分別以H-OTU、N-OTU、X-OTU標記并編號，系統發育樹分布如圖1所示。

由圖1可見，3種生境中AOA的amoA基因序列在系統發育樹中分成兩大分支，分別歸屬于FRANCIS等[9]14685定義的土壤/沉積物分支和水/沉積物分支。其中，湖泊污泥有11個序列分布于土壤/沉積物分支，24個序列分布于水/沉積物分支；稻田土壤有13個序列分布于土壤/沉積物分支，22個序列分布于水/沉積物分支；硝化污泥的全部序列都位于土壤/沉積物分支。由此可見，湖泊污泥和稻田土壤中的AOA與水/沉積物中的古菌親緣關系相近，而硝化污泥中的AOA與土壤/沉積物中的古菌親緣關系相近。

通過對各OTU中的代表序列和已知菌種序列比對發現：土壤/沉積物分支中，N-OTU1#、H-OTU6#和N-OTU12#聚于一個小分支上，與來自土壤的CandidatusNitrososphaerasp. EN76(FR 773159)的相似度為89%～94%；水/沉積物分支中，H-OTU5#、N-OTU9#、N-OTU10#和N-OTU11#與來自硝化酸性沉積物的CandidatusNitrosotaleadevanaterraisolate Nd1.(JN 227489)的相似度為88%～95%，N-OTU7#、H-OTU3#、H-OTU4#和N-OTU14#與來自海洋的NitrosopumilusmaritimusSCM1(EU 239959)相似度為83%～91%。其余的OTU聚于土壤/沉積物分支中的另外兩個小分支，推測這些簇群可能存在與已知菌種有區別的未被分離或培養的古菌?？偟膩碚f，硝化污泥的AOA全部來自土壤/沉積物分支，這可能與其單一的生存環境有關，湖泊污泥和稻田土壤的AOA既有來自水/沉積物分支，又有來自土壤/沉積物分支，可能是因為兩者周期性的反復水陸交替，而使沉積物微生物兼顧兩種特性。

圖1 3種生境中AOA的amoA基因系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree for amoA gene of AOA in 3 habitats

2.1.2 不同生境中AOA的生物多樣性

3種生境中AOA的amoA基因Shannon指數如表1所示。稻田土壤中的Shannon指數最大，為2.14，與WANG等[15]在高氮濕地沉積物中發現的AOA的amoA基因Shannon指數相近，這是因為南方稻田周期性地覆水和耕作導致了土壤生態環境的復雜性，造成了較高的AOA生物多樣性。由于湖泊岸邊濕地帶也受到湖水漲落的交替影響，有著明顯的邊緣效應[16-17]，因此其生物多樣性也較豐富，Shannon指數為1.64。硝化污泥中AOA的amoA基因生物多樣性最低，其Shannon指數僅為0.57，得到的OTU也只有2個，這是由于目前污水處理廠主要利用AOB進行硝化反應，曝氣等條件不利于AOA的生長，而且污水處理廠的環境條件相對單一，對微生物起到一定的馴化作用，從而造成硝化污泥中AOA的amoA基因生物多樣性偏低。

表1 3種生境中AOA的amoA基因Shannon指數

2.1.3 不同生境中AOA的豐度

運用實時熒光定量PCR得到湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中AOA的amoA基因豐度分別為(1.45±0.13)×107、(7.24±0.25)×105、(3.46±0.22)×105拷貝數/g(以干質量計，下同)。雖然稻田土壤中AOA的amoA基因生物多樣性高于湖泊污泥，但是豐度卻只有湖泊污泥的0.050，這可能是由于南方稻田氨氮濃度較高促進了AOB生長而使AOA在環境中處于劣勢。DI等[18]研究表明，環境中氨氮濃度的增加會促進AOB的豐度增加而對AOA的增長無明顯作用。硝化污泥中AOA的amoA基因豐度是湖泊污泥的0.024，這主要是由于硝化污泥中氨氧化微生物以AOB為主。整體上看，在湖泊污泥中AOA的amoA基因生物多樣性和豐度都較高。

目前，AOA在湖泊污泥、稻田土壤的氨氧化作用已經被證實[19-20]。近年來，在國內外多個污水處理廠中也發現有AOA的存在，并且有的污水處理廠中AOA甚至比AOB的數量還多[21-22]。

2.2 不同生境中ANAMMOX細菌的分布和豐度

2.2.1 不同生境中ANAMMOX細菌的系統發育樹分布

湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因分別得到3、4、2個OTU，分別以H’-OTU、N’-OTU、X’-OTU標記并編號，系統發育樹分布如圖2所示。

目前，已報道的ANAMMOX細菌有Anammoxoglobus、Brocadia、Jettenia、Scalindua和Kuenenia5個屬[23-25]。由圖2可見，3種生境中ANAMMOX細菌的16S rRNA序列在系統發育樹中可以聚成3個不同的分支。其中，湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中分別有34、31、15個序列分布于Brocadia分支；稻田土壤和硝化污泥中分別有4、19個序列分布于Kuenenia分支；湖泊污泥中有1個序列介于Brocadia和Kuenenia之間。由此可見，湖泊污泥、稻田土壤中ANAMMOX細菌的優勢種屬于Brocadia屬；硝化污泥中ANAMMOX細菌的Brocadia和Kuenenia幾乎各占一半，Kuenenia略占優勢，與徐亞慧等[26]研究的結果基本一致。由此可見，自然生態系統和人工水處理生態系統中均存在ANAMMOX細菌的Brocadia屬類群，這為以自然環境污泥作為厭氧氨氧化啟動的接種污泥培養富集菌種，并最終將其應用到人工水處理生態系統創造了可能性。

通過對各OTU中的代表序列和已知菌種序列比對發現：N’-OTU1#、N’-OTU3#、X’-OTU2#、H’-OTU1#和H’-OTU3#與CandidatusBrocadiafulgida(DQ 459989)的相似度為95%～99%；X’-OTU1#和N’-OTU4#與CandidatusKueneniastuttgartiensis(AF 375995)的相似度分別為96%、98%；而H’-OTU2#則介于Brocadia與Kuenenia之間。

2.2.2 不同生境中ANAMMOX細菌的生物多樣性

3種生境中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因Shannon指數如表2所示。3種生境中ANAMMOX細菌的生物多樣性不是很豐富，雖然稻田土壤生物多樣性最高，但其Shannon指數也只有0.92，說明這3種生境中ANAMMOX細菌都呈現較低的生物多樣性。

表2 3種生境中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因Shannon指數

2.2.3 不同生境中ANAMMOX細菌的豐度

運用實時熒光定量PCR得到湖泊污泥、稻田土壤和硝化污泥中ANAMMOX細菌的hzsB基因豐度分別為(1.32±0.17)×108、(2.88±0.28)×108、(7.76±0.25)×108拷貝數/g。3種生境中ANAMMOX細菌的hzsB基因豐度都較大且基本相當，原因可能是湖泊污泥和稻田土壤經常處于周期性的水陸交替狀態，存在缺/厭氧界面，當有充足的ANAMMOX細菌生長的基質和適宜的生存條件時ANAMMOX細菌就能大量繁殖。硝化污泥中的ANAMMOX細菌可能來自厭氧池或缺氧池。

圖2 3種生境中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree for 16S rRNA gene of ANAMMOX bacteria in 3 habitats

3 結 論

(1) 湖泊污泥和稻田土壤中的AOA與水/沉積物中的古菌親緣關系相近，既有來自水/沉積物分支，又有來自土壤/沉積物分支；硝化污泥中的AOA與土壤/沉積物中的古菌親緣關系相近，全部來自土壤/沉積物分支。

(2) AOA的amoA基因Shannon指數在稻田土壤中最大，生物多樣性最高，而在硝化污泥中最小，生物多樣性最低。但是，湖泊污泥中amoA基因的豐度卻遠遠高于稻田土壤和硝化污泥。

(3) 湖泊污泥、稻田土壤中ANAMMOX細菌的優勢種屬于Brocadia屬；硝化污泥中ANAMMOX細菌的Brocadia和Kuenenia幾乎各占一半。

(4) 3種生境中ANAMMOX細菌的16S rRNA基因生物多樣性都不是很豐富，但hzsB基因的豐度卻很高，甚至高于AOA的amoA基因。

4 展 望

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Distributionandabundanceofammonia-oxidizingarchaeaandanaerobicammonia-oxidizingbacteriaintypicalhabitats

XUXianglong1,CHENXiangchun2,LIUGuohua1,FANQiang1,WANGHao1,RENZhengguang1,QILu1,WANGHongchen1.

(1.SchoolofEnvironment&NaturalResources,RenminUniversityofChina,Beijing100872;2.JinanDistrictHeatingLimitedCompany,JinanShandong250100)

The distribution and abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and anaerobic ammonia-oxidizing (ANAMMOX) bacteria in typical habitats of lake sediment,paddy soil and nitrification sludge were investigated using molecular biology methods. Results showed thatamoA gene Shannon indexes of AOA in lake sediment,paddy soil and nitrification sludge were 1.64,2.14 and 0.57,respectively,indicating the richest biodiversity in paddy soil. However,amoA gene abundances of AOA in the 3 above habitats were (1.45±0.13)×107,(7.24±0.25)×105and (3.46±0.22)×105copies/g (dry weight),respectively,indicating the highest gene abundance in lake sediment. AOA in lake sediment and paddy soil was close to archaea of water/sediment branch,deriving from water/sediment branch or soil/sediment branch. AOA in nitrification sludge was close to archaea of soil/sediment branch,all deriving from soil/sediment branch. 16S rRNA gene Shannon indexes of ANAMMOX bacteria in the 3 above habitats were all low,indicating a poor biodiversity. However,hzsB gene abundance of ANAMMOX bacteria in the 3 above habitats reached (1.32±0.17)×108,(2.88±0.28)×108and (7.76±0.25)×108copies/g (dry weight),respectively. The dominant species of ANAMMOX bacteria in lake sediment and paddy soil belonged toBrocadiawhile that in nitrification sludge belonged toBrocadiaandKueneniaalmost equally.

AOA; ANAMMOX bacteria; biodiversity; gene abundance

徐相龍，男，1989年生，碩士研究生，主要從事污水的厭氧氨氧化脫氮技術研究。#

。

*中央高?；究蒲袠I務費專項(No.15XNLD04)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2016.12.012

編輯:陳錫超 (

2016-06-13)