基于中藥材DNA條形碼系統的澤瀉種子鑒別研究＊

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193；2.南京中醫藥大學藥學院 南京 210046）

張娜娜1，辛天怡1，金 鉞1，谷 巍2，宋經元1＊＊

Zhang Nana1, Xin Tianyi1, Jin Yue1, Gu Wei2, Song Jingyuan1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

基于中藥材DNA條形碼系統的澤瀉種子鑒別研究＊

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193；2.南京中醫藥大學藥學院 南京 210046）

張娜娜1，辛天怡1，金 鉞1，谷 巍2，宋經元1＊＊

目的：以澤瀉種子為研究對象，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統區分不同產地澤瀉的基原物種。方法：采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，擴增核內部轉錄間隔區ITS2序列并進行測序。利用軟件CodonCode Aligner 6.0.2和MEGA 5.1對序列進行拼接，并用體式顯微鏡觀察記錄種子外觀形態特征。結果：澤瀉Alisma plantago-aquatica和東方澤瀉Alisma orientale種子外觀形態相似；兩個物種的ITS2序列長度均為311 bp，GC含量為56.9%，ITS2序列在165 bp處存在T-A變異。該鑒定結果顯示，20份四川產澤瀉種子樣本序列為澤瀉A. plantago-aquatica，其他產區36份樣本均為東方澤瀉A. orientale。結論：中藥材DNA條形碼鑒定系統可為選擇正確基原的澤瀉種質提供指導，該系統在澤瀉人工栽培生產中具有重要應用價值，可為其他中藥材種子鑒定提供示范。

DNA條形碼 澤瀉 東方澤瀉 種子鑒定 ITS2

常用中藥澤瀉主要含有四環三萜類化合物、揮發油、生物堿、天冬素、植物甾醇、脂肪酸、氨基酸等多種成分，性甘、淡、寒，歸腎、膀胱經，具有抑制動脈粥樣硬化、降血脂、利尿、降血壓、抗脂肪肝的作用[1-4]。一般來說，澤瀉商品藥材包括澤瀉Alisma plantago-aquatica和東方澤瀉Alisma orientale，目前對兩個物種并未進行明確的區分[5]。兩者中文名稱也比較混亂，《中國藥典》規定澤瀉藥材為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖，在《中草藥大典》中也有相似記載[1，6]。但《中國植物志》對兩個物種中文名稱分別記載為澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale[7]。本文中的澤瀉藥材為廣義上各類澤瀉藥材的統稱，其基原包括：澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale兩個物種。澤瀉藥材栽培產區主要分布于四川、福建、江西等地，通常分為建澤瀉、川澤瀉和江澤瀉，其中建澤瀉和川澤瀉分布較廣泛[8]。不同產地不同種質的澤瀉藥材其微量元素、氨基酸及澤瀉醇等成分的含量存在差異[9]。目前，澤瀉科植物的常規分類方法主要依賴于其植物的形態和生理特性，鑒別難度較大。近年來，分子鑒定技術逐漸受到藥材鑒定人員的廣泛關注，如黃瓊林等[10]從GenBank下載澤瀉科植物序列 進行分析，發現核內部轉錄間隔區ITS2序列對澤瀉科植物有較好區分作用；馬曉沖等[11]以澤瀉塊莖和葉片為材料對此進行研究和驗證。但到目前為止，對澤瀉種子的鑒別研究尚未見報道。澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale兩者的成熟種子外觀差別很小，傳統的性狀鑒別難以區分，在藥材生產加工和臨床應用中極易出現品種混雜現象，影響澤瀉的藥材品質和臨床療效。

藥用植物資源是中藥材生產的源頭，種質影響藥材的最終質量，選擇正確種源對中藥育種和資源保護具有重要意義[12]。然而，在藥材栽培的實際生產中，種質混雜現象十分嚴重，例如川牛膝，由于其種子量不足，部分不良商家將麻牛膝混入川牛膝種子中，使藥材原植物發生天然雜交，致使藥材品質的退化[13]。再如半夏種莖中經常夾雜天南星、虎掌半夏，由于三者性狀差異較小，肉眼難以準確識別，只能待植株長到一定高度才能辨別[12]。另外，由于植物性狀的相似性，一些細小種子（如菟絲子、沙苑子、地膚子、天仙子等）也經常被混淆[14]。因此，尋找一種適用于種質的準確鑒定方法成為解決以上問題的關鍵。

藥用植物DNA條形碼鑒定技術從基因層面解決了藥材品種鑒別問題。近年來，該技術得到了迅速發展，與二維碼技術的結合應用使該方法的應用更加便捷和廣泛[15，16]。大量實驗研究證明，該鑒定方法具有穩定性和可靠性，成為傳統鑒定的一個有力補充，為中藥材的鑒定工作提供了科學指導[17]。該技術通過核基因組中一段特定的DNA序列，以中草藥DNA條形碼鑒定數據庫為依據，對不同的物種進行區分，為解決中草藥的品種考證和中藥材常見混偽品問題奠定技術基礎[15，17]。為區分不同產地澤瀉的基原物種，本研究通過DNA條形碼技術，以ITS2序列對來自不同產區的澤瀉種子進行鑒定研究。

1 實驗材料

本研究共收集澤瀉種子樣品56份。其中，20份分別來自四川主產區眉山市彭山縣義和鎮、謝家鎮、公義鎮、鳳鳴鎮和白馬鎮；8份收集自澤瀉主要種植栽培區福建省建甌市；13份樣品來自江西省撫州市廣昌縣；在云南省紅河州（紅河哈尼族彝族自治州）、江蘇省南京市和北京市共收集到樣品15份。采集過程中，由當地種植人員提供樣品（名稱均為澤瀉）。對實驗樣品進行統一編號，樣品具體信息見表1。

2 實驗方法

利用體式顯微鏡（SZX9）觀察種子的形態特征并拍照記錄。用酒精棉擦拭藥匙，取澤瀉種子約20 mg（大約20粒），用MM400混合型碾磨儀（Retsch Co.，德國）30次/s研磨2 min，采用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總DNA。本研究的操作步驟依照該試劑盒說明書并做了適當修改：（1）65℃水浴4 h，水浴過程中注意顛倒混勻數次；（2）以預冷的異丙醇替代緩沖液GP2，取500 μL加入上清液中后顛倒混勻，-20℃放置20 min；（3）用100 μL滅菌雙蒸水洗脫DNA[15]。PCR擴增后進行雙向測序，PCR擴增引物及反應條件參照馬曉沖等的研究[11]。

3 數據處理

利用CodonCode Aligner 6.0.2對測序結果進行校對拼接，去除低質量區。利用隱馬爾可夫模型HMMer對拼接好的序列進行5.8S和28S區域剪切，得到ITS2序列。將所得樣品ITS2序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統（http://www.tcmbarcode.cn/ china/）中進行物種鑒定。利用軟件MEGA5.1對樣本序列進行分析，并且根據K2P模型計算遺傳距離，確定單倍型，比較種內種間變異大小。

表1 樣品采集地信息

4 結果與分析

4.1 不同產地澤瀉種子分子鑒定結果和表觀形態分析

來自全國不同產地澤瀉種子樣品，經過ITS2序列比對分析顯示全部樣品共分為兩個物種，四川產20份樣本為澤瀉A. plantago-aquatica，其他36份樣本均為《中國藥典》（2010年版）規定的基原物種東方澤瀉A. orientale，而種子采集地對兩個物種并未進行區分。形態觀察顯示，單粒種子兩側扁，先端鈍圓，表面灰黃色，長約為2 mm，寬約1 mm，背部有1-2淺溝，與文獻描述一致[18]。如圖1所示，澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale種子形態差異較小，且體積微小，肉眼辨別難度很大。

4.2 不同澤瀉種子峰圖質量

DNA樣品為來自約20粒種子的混合模板，經PCR擴增后測序，澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale樣品ITS2序列峰圖質量很高，無套峰出現。56次重復實驗結果顯示圖譜均如圖2所示，標志著兩個物種內部無變異，遺傳穩定。

4.3 ITS2序列特征和種間種內變異分析

澤瀉A. plantago-aquatica種子樣本ITS2序列長度為311 bp，GC含量為56.9%，東方澤瀉A. orientaleITS2序列長度和GC含量與其相同。兩個物種序列在第165個堿基處存在A-T變異，來自四川產區的澤瀉A. plantago-aquatica樣本序列表現為T，其他產區東方澤瀉A. orientale測定結果為A。基于K2P模型計算遺傳距離，東方澤瀉A. orientale種內平均K2P為0，澤瀉A. plantago-aquatica種內平均K2P為0，種間遺傳距離為0.003 2，成功區分兩個物種。此結果說明：DNA提取所用的20粒種子混合樣品，測序峰圖質量很好，無其他變異。

圖1 體式顯微鏡下種子的形態特征

5 討論

5.1 澤瀉種子DNA提取、PCR以及測序

種子類實驗材料細胞壁較難分解[14，19]。因此，與葉片類相比，澤瀉種子樣品加裂解液GP1后的水浴時間需要延長為4 h。參考文獻[20]的標準操作流程進行DNA提取、PCR擴增以及測序按照種子類藥材DNA條形碼鑒定，提取過程中未出現疑難點。因為物種內部可能存在高水平的種內遺傳多態性，實驗結果可能存在多模板干擾，研究者曾在唐古特大黃Rheum tanguticum中發現在ITS2序列500-550 bp處存在高頻率堿基顛倒現象[21]。本研究取樣時多個體同時進行DNA提取，分析結果顯示峰圖質量很好，未出現套峰、亂峰現象，這證實澤瀉基因組內的ITS2主導變異占絕對優勢，這與人參等物種的情況一致[22]。多批次樣品的實驗結果顯示，ITS2序列對澤瀉種子的鑒定具有重復性強、穩定性高的特點。

5.2 DNA條形碼對澤瀉種子及中藥材種子種苗鑒定的意義

圖2 澤瀉種子的高質量ITS2序列峰圖

種質的優劣決定中藥的產量和質量，種質鑒定是確定藥材基原植物，確保藥效和合理利用種質資源的基礎[23]。傳統形態學鑒定方法在種質表觀形態差別較小的情況下，鑒定難度較大，易出現偏差。而從分子生物學角度，即基因層面進行研究，比較DNA序列上的差異，不受樣品形態限制，減少了人為主觀因素影響，使鑒定結果更加準確。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內變異[24，25]。黃瓊林等[10]通過對GenBank中澤瀉科植物澤瀉屬、毛茛澤瀉屬、澤薹草屬、慈姑屬4個屬鑒定序列的適用性篩選發現，在ITS2、rbcL、matK3個候選序列中，rbcL和matK序列種間和種內變異重疊較多，鑒定效率低，而ITS2序列種間變異程度高，與種內變化水平差異顯著，在澤瀉科鑒定中有明顯優勢，其中澤瀉屬研究樣本涵蓋了澤瀉A. plantagoaquatica和東方澤瀉A. orientale兩個物種。以澤瀉塊莖、葉片為材料，ITS2序列能區分澤瀉和藥材的混偽品[11]。本研究首次以澤瀉種子樣品為研究對象發現2個物種ITS2序列長度均為311 bp，同一物種內部無變異現象，種間存在一個穩定變異位點，與馬曉沖等[11]的研究結果一致，可有效區分兩個物種，同時驗證ITS2序列在澤瀉鑒定應用的穩定性。中藥材DNA條形碼鑒定系統能夠為正確基原澤瀉種質的選擇提供強有力指導，在澤瀉人工栽培生產中具有重要應用價值，也為其他中藥材種子種苗鑒定提供了參考。

致謝

感謝南京中醫藥大學耿超博士在樣本收集上提供的幫助，感謝中國醫學科學院藥用植物研究所瀕危藥材繁育國家工程實驗室協助完成此項工作。

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Identification of Alisma plantago-aquatica Seeds Based on Traditional Chinese Medicine DNA Barcoding System

This study was aimed to authenticate the Alisma plantago-aquatica seeds from different producing areas with the Traditional Chinese Medicine (TCM) DNA barcoding system. The total genomic DNA was extracted using plant DNA extraction kit. The internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions were amplified and sequenced. The sequences were assembled by the CodonCode Aligner 6.0.2 and analyzed by MEGA5.1. The morphological characteristics of seeds were observed using microscope. The results showed that the morphological characteristics of Alisma plantago-aquatica seeds and Alisma orientale seeds were similar. The ITS2 sequence lengths of both species were 311 bp. The GC content was 56.9%. One stable SNP (T-A) was detected at 165 bp in the ITS2 sequence. The identification results showed that 20 samples collected in Sichuan province were identified as A. plantago-aquatica, while 36 samples from other producing regions were A. orientale. It was concluded that the TCM DNA barcoding system can provide guidance for the accurate selection of Alisma plantago-aquatica seeds. This system had important application value in the cultivation of Alisma plantago-aquatica. It also provided demonstration for the identification of other TCM seeds.

DNA barcoding, Alisma plantago-quatica, Alisma orientale, seed identification, ITS2

Zhang Nana1, Xin Tianyi1, Jin Yue1, Gu Wei2, Song Jingyuan1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

10.11842/wst.2016.01.003

R931.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-07

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81373922）：基于ITS2互補堿基變化分析的中藥基原物種鑒定研究，負責人：宋經元。

＊＊ 通訊作者：宋經元，本刊編委，研究員，博士生導師，主要研究方向：中藥資源學。