應用DNA條形碼技術鑒定中藥材酸棗仁＊

任 莉，陳新連，石林春，辛天怡，龐曉慧

（中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

應用DNA條形碼技術鑒定中藥材酸棗仁＊

任 莉，陳新連，石林春，辛天怡，龐曉慧＊＊

（中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：利用DNA條形碼鑒定技術對中藥材酸棗仁及其混偽品進行分子鑒定。方法：對研究材料進行DNA提取、PCR擴增和雙向測序，利用CodonCode Aligner拼接后，將所得序列轉換為彩色條形碼圖片及二維DNA條形碼。用軟件MEGA進行遺傳距離分析，構建NJ（鄰接）樹。結果：酸棗仁基原植物酸棗的ITS2序列種內遺傳距離為0-0.009，遠小于其與混偽品的種間遺傳距離（0.084-0.190）；由所構建的NJ樹可以看出，酸棗不同來源的樣本聚在一起，表現出單系性。結論： ITS2 條形碼能夠有效地鑒別酸棗仁藥材與其混偽品，為保障其用藥安全提供新的技術手段。同時，專屬二維DNA條形碼可以跨平臺快速獲取酸棗仁的DNA條形碼信息，實現對該藥材市場流通的數字化監控。

酸棗仁 ITS2 分子鑒定 二維碼 DNA條形碼

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，其性平，味甘、酸，具有養心補肝、寧心安神、斂汗、生津的功效，臨床用于治療多種類型失眠癥和神經衰弱[1，2]。現代藥理學研究表明：酸棗仁具有抗焦慮、抗抑郁、抗衰老等作用，還能降血脂及防治動脈硬化[3-6]。近年來，隨著對酸棗仁藥理作用研究的深入，其臨床應用更加廣泛，市場需求量增大，其藥材混偽現象日益嚴重。最常見混偽品有其同屬植物滇刺棗Ziziphus mauritiana Lamarck的種子理棗仁及同科植物北枳椇Hovenia dulcis Thunb. 的種子枳椇子[7]。理棗仁為云南地區習用品，其他各地不用，不應做酸棗仁藥用；枳椇子為少常用中藥，是止咳除煩、清濕熱解酒毒的藥材，與酸棗仁功效用途不同，三者若區分不清將會嚴重影響酸棗仁的藥材質量[8]。因此，為確保藥材質量以及臨床用藥安全有效，準確鑒別酸棗仁及其混偽品十分必要。

目前，已有研究對酸棗仁的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜、紫外、紅外、RAPD分析和FTIR指紋圖譜等進行了報道[9-13]。DNA 條形碼鑒定技術在酸棗仁鑒定方面尚無相關報道。由于該方法具有操作簡單、快速準確等特點，已成為近年來生物分類和鑒定的研究熱點[14-21]。其中，以ITS2為主，psbA-trnH為輔的藥用植物條形碼鑒定體系一經提出便得到廣泛關注與認可，現已納入《中國藥典》[22-27]。郭力城等[28]利用ITS2條形碼對中藥材金沸草、旋覆花及其近緣混偽品進行了鑒定研究，發現ITS2條形碼可有效鑒別多基原藥材金沸草和旋覆花及其同屬近緣混偽品。趙莎等[29]選用ITS2條形碼對五加皮進行鑒定研究，發現ITS2條形碼可對五加皮進行準確鑒定。于俊林等[30]研究了ITS2條形碼對柴胡藥材鑒定的準確性，結果表明ITS2條形碼可準確、穩定地鑒定柴胡。為了解決酸棗仁藥材的真偽鑒別問題，本研究首次采用ITS2條形碼對酸棗仁藥材及其混偽品進行分子鑒定，以期為該藥材的準確鑒定和安全用藥提供參考。

1 材料

本研究共收集31份實驗材料，其中酸棗仁樣品29份，包含藥材樣品26份，原植物樣品3份；其混偽品樣品2份，包含枳椇1份，理棗仁藥材1份。以上所有樣品均經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證樣本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所。另外，從GenBank下載1條北枳椇的序列，樣品信息詳見表1。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增及測序

將酸棗種子切成小塊，稱取20-40 mg，用DNA提取研磨儀（Retsch MM400，德國）研磨2 min （30 次/s）后，采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.， 中國）提取總DNA。PCR反應體積25 μL，PCR反應體系、ITS2通用引物以及擴增程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則”[23]。PCR產物經純化后，使用ABI3730XL 測序儀（Applied Biosystems Co.，美國）進行雙向測序。

2.2 數據處理

利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，美國）校對拼接測序峰圖，并去除其引物區。將所獲序列及GenBank下載序列采用HMMer注釋方法去除兩端5.8 S 和28 S 區段獲得ITS2序列[31]。將所得ITS2序列用MEGA5.1分析比對， 確定不同單倍型[32]。將各藥材ITS2序列基于本課題組編寫的代碼轉換為彩色條形碼圖片，并基于開源代碼PHP QR Code 編碼方式對所得ITS2序列及相應物種拉丁名進行編碼，將該序列轉為二維碼圖片[33]。基于K2P 模型進行遺傳距離分析， 用鄰接（NJ）法構建系統聚類樹。

表1 樣本信息

3 結果

3.1 酸棗仁種內變異分析

本研究中酸棗共29條ITS2序列長度均為221 bp，GC含量為68.3%-69.2%。酸棗序列間存在2個變異位點，分別為88位點C-T變異與94位點A-G變異，分為3種單倍型，種內遺傳距離為0-0.009，其主導單倍型序列特征如圖1。

圖1 酸棗仁DNA條形碼及二維DNA條形碼圖片（ATC■G）

圖2 各物種DNA條形碼及二維DNA條形碼圖片（ATC■G）

3.2 酸棗仁及其混偽品種間變異分析

滇刺棗、枳椇以及北枳椇的序列長度分別為218 bp、215 bp和213 bp，GC含量分別為70.6%、69.3%與69.5%，各物種序列特征如圖2。酸棗與滇刺棗、枳椇、北枳椇間存在較多變異位點，遺傳距離為0.084-0.190，遠大于酸棗的種內遺傳距離。

3.3 酸棗仁的聚類分析

基于ITS2序列構建酸棗仁及其混偽品的NJ樹（圖3），可以看出酸棗單獨聚為一支，支持率為99%，呈現出明顯的單系性，與其混偽品能夠明顯區分開。由此可見，構建NJ樹法可成功鑒別酸棗仁及其混偽品。

圖3 基于ITS2 序列構建的酸棗仁及其混偽品的鄰接（NJ）樹

4 討論

4.1 酸棗仁的DNA提取

種子類藥材在DNA提取過程中，往往存在油脂含量高和粉碎困難等問題。辛天怡等[33]進行中藥材二維DNA條形碼研究時，去除了研究樣品的果皮、種皮，并將其切成小塊，再加入PVP-40進行研磨。凃媛等[34]在提取南北葶藶子DNA時，用球磨儀以50 次/s研磨2 min，再利用植物DNA提取試劑盒進行提取。王俊等[35]提取蒼耳子藥材DNA時，先將蒼耳子藥材切開，再進行DNA提取。本研究在進行酸棗仁藥材DNA提取時，先將其切成小塊，再加入樣本量10% 的PVP-40。后續按照試劑盒說明書步驟進行操作，一般都能成功提取其DNA，PCR產物電泳后條帶單一明亮。

4.2 酸棗仁混偽現象普遍

據文獻報道，市場中常見酸棗同屬植物滇刺棗的種子理棗仁及同科植物北枳椇的種子枳椇子充當酸棗仁出售[7]。本研究發現酸棗仁混偽現象確實較為常見，從各地市場及藥店共收集31份酸棗仁藥材樣品，利用DNA條形碼對收集的樣品進行檢測，發現有一份樣品（DCZ01）不是酸棗，而是滇刺棗，另有一份鑒定結果為枳椇（ZJZ01）。文獻報道枳椇子基原植物為北枳椇，但本研究中所獲得的酸棗仁偽品經鑒定為枳椇，經查閱文獻發現枳椇與北枳椇中文名和拉丁名存在混亂現象，因此本文將枳椇也納入酸棗仁混偽品行列進行鑒定研究[7，36]。

4.3 酸棗仁二維DNA條形碼

根據辛天怡[33]等提出的中藥材二維DNA條形碼流通監管體系，本研究將所得ITS2條形碼轉換為彩色條形碼圖片，形象化展示各藥材DNA條形碼序列。同時，將所得序列轉換為二維碼圖片，此二維碼圖片可被不同移動終端的各類二維碼掃描軟件識讀。因此，在酸棗仁種植、加工、收購、零售等各個環節中，均可通過此鑒定體系為每份藥材提供專屬二維DNA條形碼，以便實地抽檢與二次核實，保障正品來源。由此可見，通過二維DNA條形碼流通監管體系可以跨平臺快速獲取中藥材的DNA條形碼信息，實現對中藥材市場流通的數字化監督，為解決中藥材市場混偽問題提供新的技術手段。

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Identification of Ziziphi Spinosae Semen Using DNA Barcoding Technology

Ren Li, Chen Xinlian, Shi Linchun, Xin Tianyi, Pang Xiaohui
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was aimed to identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. DNA of the studied materials was extracted, PCR amplified and bidirectionally sequenced. All sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The obtained sequences were transformed into chromatic barcode images and twodimensional DNA barcode. The MEGA software was used in the analysis of genetic distance and the construction of neighbor-joining (NJ) tree. The results showed that the intraspecific genetic distances of internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences of Ziziphus jujube Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou were from 0 to 0.009, which were much less than the interspecific genetic distances between Z. jujuba var. spinosa and its adulterants (0.084-0.190). The constructed NJ tree showed that samples from different origins of Ziziphi Spinosae Semen clustered into a monophyly clade. It was concluded that ITS2 barcode can effectively identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. It provided new technical means to guarantee medication safety. Meanwhile, the exclusive two-dimensional DNA barcode allowed the quick obtaining of cross-platform DNA sequence information for the realization of digital monitoring of this medicine in the market circulation.

Ziziphi Spinosae Semen, ITS2, molecular identification, two-dimensional code, DNA barcoding

10.11842/wst.2016.01.006

R931.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-07

＊ 國家自然科學基金面上項目（81573541）：淫羊藿屬藥用植物超級條形碼及其分類學研究，負責人：龐曉慧。

＊＊ 通訊作者：龐曉慧，博士，副研究員，主要研究方向：中藥分子鑒定研究。