雞血藤、滇雞血藤、大血藤等血藤類藥材的psbA-trnH條形碼分子鑒定＊

周 紅，馬雙姣，陳貝貝，韓正洲，姚 輝＊＊

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 華潤三九醫藥股份有限公司研發中心 深圳 518110）

雞血藤、滇雞血藤、大血藤等血藤類藥材的psbA-trnH條形碼分子鑒定＊

周 紅1，馬雙姣1，陳貝貝2，韓正洲2，姚 輝1＊＊

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 華潤三九醫藥股份有限公司研發中心 深圳 518110）

目的：中國藥典收載的雞血藤、大血藤、滇雞血藤及相關物種均有“血藤”之稱，其各自的來源不同，功效主治不同，不能混用。為確保其臨床用藥的安全、有效，本研究應用DNA條形碼序列psbA-trnH對雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品進行鑒定研究。方法：通過對樣本進行基因組DNA提取，PCR擴增psbA-trnH序列。所得序列經拼接后，用MEGA5.0和DNAMAN進行種內種間序列分析，構建NJ樹，對psbA-trnH序列在血藤類藥材中的鑒定能力進行評估。結果：雞血藤、大血藤和滇雞血藤序列長度和GC含量各不相同，psbA-trnH種內序列相似度高，均高于它們與混偽品間的序列相似性。雞血藤、大血藤、滇雞血藤與其他非藥典收載的血藤類藥材的種間最小K2P距離分別為0.137、0.426和0.003，均大于其種內最大遺傳距離0.014、0.004和0。在NJ樹中，雞血藤、大血藤均單獨聚為一支，能明顯的與其他混偽品區分開，滇雞血藤與異形南五味子聚為一支。結論：psbA-trnH序列能準確鑒定雞血藤、滇雞血藤、大血藤藥材及其混偽品，該條形碼分子鑒定方法可作為傳統鑒定方法的有效補充。

psbA-trnH 雞血藤 大血藤 滇雞血藤 DNA條形碼

就藤類藥材而言，凡是皮色發紅或鮮品被斬斷時有紅色汁液流出的，習慣用“血”、“赤”、“紅”等字命名，這些混雜重疊的不規范藥名，給實際用藥帶來極大的麻煩。有關報道顯示，正名、異名作“血藤”的中藥有8種之多[1]。由于藥材功效相近或存在同名異物、同物異名等原因，使之容易混淆，加之市場流通中的部分藥材外形不完整，鑒別特征部分缺失等造成鑒定困難。但他們的基原植物屬于不同的科屬，且功能主治各異，不能混用。例如，2015版藥典中收載的大血藤Sargentodoxae Caulis為木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata （Oliv.） Rehd. et Wils.的干燥藤莖，滇雞血藤Kadsurae Caulis為木蘭科植物內南五味子Kadsura interior A.C. Smith的干燥藤莖[2]。雞血藤Spatholobi Caulis的本草記載存在差異，進一步加劇了其用藥的混亂。1960版《中藥志》以豆科植物白花油麻藤Mucuna birdwoodiana Tutch.為雞血藤正品[3]；《廣州植物志》和《中國植物高等圖鑒》將豆科崖豆藤屬網絡崖豆藤Millettia reticulate Benth.定為雞血藤原植物。1977版《中藥大辭典》[1]、1990版-2015版《中華人民共和國藥典》收載的雞血藤均為豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖[2,4-8]。由于這些植物藤莖被斬斷后，木質部會立即出現淡紅棕色，不久慢慢變成鮮紅色汁液流出，因此它們均有“血藤”之稱，也都有“活血調經”的功效，但不同血藤類藥材性味歸經及主治各異。如大血藤性苦，平，歸大腸、肝經，有清熱解毒、消癰散結的功效，善散腸中瘀滯，為治療腸癰腹痛要藥[9]；雞血藤與滇雞血藤均性苦、甘，溫，歸肝、腎經。雞血藤活血作用較強，長于舒筋活絡，為風濕痹痛及血虛有瘀諸證之常用藥，滇雞血藤補血作用較雞血藤強。為了確保“血藤”類藥材的用藥準確、安全、有效，亟需找到一種快速、準確的鑒定方法。

目前，國內外對血藤類中藥材的研究主要集中在化學成分、藥理作用等方面，其鑒定主要依賴性狀、顯微、理化性質等方面[10-13]。分子鑒定研究較少，翟明等[14]曾對雞血藤類藥材的種質資源進行RAPD分析，安冉等[15]基于26S rDNA D1-D3 區序列差異對雞血藤及其混偽品進行分子鑒別。孫稚穎等[16]曾采用硅膠干燥葉片獲得ITS2序列對藥典中收載的14種藤類藥材進行鑒定研究。黃瓊林等[17]基于matK基因對雞血藤及其混偽品進行了分子鑒定。相關研究發現，psbA-trnH序列在植物中進化速率較快，長度適宜，兩端存在保守序列，容易設計通用引物，且該片段的引物具有高通用性、高擴增成功率等特點[18]。本研究以雞血藤、大血藤、滇雞血藤藥材及其混偽品為研究對象， 分析其psbA-trnH序列種內和種間變異，旨在為血藤類藥材的用藥安全及質量控制提供分子鑒定依據。

表1 實驗樣品信息表

1 實驗材料與方法

1.1 材料

本研究共收集樣品79份，涉及3個科的8個不同物種，包括雞血藤42份，大血藤16份，滇雞血藤6份，其他血藤類15份，分別來自越南、廣西、廣東、湖北、云南、河北、安徽、廣州、北京等地。以上所有實驗樣品經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定無誤，樣品詳細信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

實驗藥材用75%乙醇擦試表面后晾干，稱取40-45 mg，用DNA提取研磨儀（Retsch MM400, 德國）研磨2 min（30次/秒）后，參照《中華人民共和國藥典》（2010年版第三增補本）中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則[19]規定的莖木類藥材DNA提取方法提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序

psbA-trnH序列擴增用正向引物為5'-GTTAT GCATGAACGTAATGCTC-3'，反向引物為5'-CGC GCATGGTGGATTCACAATCC-3'。PCR反應體積為25 μL，反應體系及擴增程序參照陳士林主編的著作《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》[20]。PCR產物經純化后，使用ABI 3730XL（Applied Biosystems Co.，美國）測序儀進行雙向測序。

1.2.3 數據處理

測序峰圖經校對拼接，去除引物區和低質量區；將所有序列用軟件MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）分析[21]，并基于K2P模型進行遺傳距離等分析，用鄰接（NJ）法構建系統聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的支持率。并利用DNAMAN 6.0對序列進行相似性分析。

表2 雞血藤（Sp. suberectus）psbA-trnH序列變異位點

表3 血藤類藥材的psbA-trnH序列特征

2 結果與分析

2.1 序列信息及變異分析

實驗獲得血藤類藥材psbA-trnH序列長度為240-451 bp，GC含量為22.1%-41.3%，其中雞血藤psbA-trnH序列42條，序列長299 bp，GC含量為22.1%-22.6%，平均GC含量為22.2%，共獲得5種不同的單倍型，出現了7處變異，如表2所示。大血藤psbA-trnH序列16條，序列長240 bp，GC含量為41.3%，共獲得2種不同的單倍型a1（14條）、a2（2條）。僅在38位點處存在A-T變異。內南五味子psbA-trnH序列6條，異形南五味子psbA-trnH序列1條，序列長度均為328 bp，6條內南五味子序列一致，GC含量為36.3%。內南五味子與異形南五味子psbA-trnH序列僅在218位點處存在A-C變異，詳細序列信息見表3。

2.2 種內及種間變異分析

應用MEGA 5.0軟件，基于K2P遺傳距離模型，對各種血藤進行種內種間變異分析，藥典收載的物種雞血藤、大血藤、滇雞血藤與其他非藥典收載的血藤類藥材的種間最小K2P距離分別為0.137、0.426和0.003，均大于其種內最大遺傳距離0.014、0.004和0。它們與其他血藤的種間平均K2P距離分別為0.506、0.779和0.822。

應用DNAMAN軟件對各種血藤類藥材的psbA-trnH序列進行序列相似性比較分析，結果如表4所示，雞血藤、大血藤psbA-trnH序列種內相似度非常高，為98%-100%，遠高于它們與混偽品間的序列相似性。滇雞血藤psbA-trnH序列種內的相似度為100%，與其他血藤類藥材序列相似度為30.7%-99.7%，其中與異形南五味子的序列相似度最高，相似度為99.7%。

2.3 NJ樹分析

以研究樣本的單倍型構建NJ樹，結果發現，雞血藤、大血藤均單獨聚為一支，且具有較高的自展支持率，分別為100%、93%，能明顯與其他血藤類物種區分開。滇雞血藤藥材的基原物種內南五味子與異形南五味子在NJ系統發育樹中聚為一支，與其他血藤類藥材可明顯區分（如圖1所示）。

表4 雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品的序列相似性分析/%

圖1 基于psbA-trnH序列構建的雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品的鄰接（NJ）樹

3 討論

由于本草記載的差異和地方用藥習慣的不同導致中藥的學名、別名繁多混亂，出現“異藥同名”和“同名異藥”的現象，它是導致藥材誤用或混用的主要原因之一，給中藥材的流通與監管帶來不便。藥材的誤用、混用又會造成“病準-方對-藥不靈”的現象，嚴重影響中醫臨床療效，延誤中醫治療，甚至損害患者健康，曾經的“關木通事件”和“廣防己事件”就引發了全世界的關注和討論。為確保中藥材的質量、療效和安全性，對中藥材的準確鑒定可從源頭上提供保障。DNA條形碼分子鑒定方法具有獨特的3大優勢：方法通用性強、鑒定結果可重復性好、可構建統一數據庫和鑒定平臺，易于推廣和標準化[22]，該方法對于同名異藥、異藥同名藥材的鑒定已有較多的研究報道。辛天怡[23]等基于DNA條形碼序列ITS2成功鑒定了“胡麻”類藥材，馬曉沖[24]、夏葉[25]等分別應用DNA條形碼技術成功鑒定了“木香”類藥材和“功勞葉”藥材。psbA-trnH序列因其序列變異性高，是ITS2序列的補充，共同作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。在中藥材的鑒定中也有較多的應用，Yao等[26]、楊培等[27]、Sun 等[28]、He等[29]、Li等[30]分別應用psbA-trnH序列對石斛類藥材、藥食同源肉桂類藥材、金銀花和山銀花等藥材、烏頭屬藥材、桑寄生藥材進行鑒定研究。本研究基于psbA-trnH序列，應用DNA條形碼技術通過計算K2P遺傳距離、序列相似性分析及構建NJ樹的方法對“血藤”類藥材進行鑒定并獲得成功，復核樣本[31]YC0001MT29*、YC0279MT17*、YC0279MT18*、YC0699MT02*、YC0699MT05*由中國中醫科學院中藥研究所進行復核，同一實驗樣本獲得的序列一致，說明采用DNA條形碼技術鑒定血藤類藥材具有很好的重復性和穩定性。psbA-trnH序列可有效鑒定不同種的血藤類藥材，對Pang 等[32]、He等[29]研究中發現的psbA-trnH序列存在的inversion現象，在本研究的幾個物種中暫未發現。

滇雞血藤基原植物內南五味子K. interior在《Flora of China》中已被合并至異形南五味子K. heteroclita中。Saunders[33]也于1998年將K. interior歸并入K. heteroclita。有研究者對兩個物種的葉表皮形態特征[34]、種子形態[35]進行了對比，認為它們應為同一物種，且其化學成分和藥理作用[36]也比較相似。本研究發現內南五味子與異形南五味子的psbA-trnH序列差異很小，序列相似度高，在NJ系統發育樹中聚為一支，從系統發育的角度看，此兩種植物的親緣關系很近。由于內南五味子K. interior僅分布于云南西南部（保山、鳳慶、臨滄、耿馬），而異形南五味子K. heteroclita的分布較為廣泛，在中國華南至西南地區均有分布。因此，此兩種植物的合并對擴大中藥材滇雞血藤的藥材來源具有十分重要的意義。

致謝

感謝復旦大學藥學院盧燕副教授提供部分實驗樣品及中國中醫科學院中藥研究所對部分樣品進行的復核實驗！

1 江蘇新醫學院.中藥大辭典.上海:上海人民出版社, 1977： 1206, 1208.

2 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫藥科技出版社, 2015： 20, 194, 362.

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4 衛生部藥典委員會.中國藥典(一部).北京:人民衛生出版社, 1990： 163.

5 衛生部藥典委員會.中國藥典(一部).廣州:廣東科學技術出版社, 1995： 162.

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7 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:化學工業出版社, 2005： 134.

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Zhou Hong1, Ma Shuangjiao1, Chen Beibei2, Han Zhengzhou2, Yao Hui1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Research Center, China Resources of Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518110, China)

Identification of Spatholobi Caulis, Kadsurae Caulis and Sargentodoxae Caulis UsingThe psbA-trnH Barcode

Spatholobi Caulis,Sargentodoxae Caulis and Kadsurae Caulis recorded in the Chinese Pharmacopoeia were all called “Xueteng”. Because of their different sources and efficacies, they cannot be misused. In order to ensure their clinical safety and efficacy, the psbA-trnH region was used to identify Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis and their adulterants. Total genomic DNA was extracted, and the psbA-trnH region was amplified and sequenced. The intra- and inter-specific genetic distances were computed using MEGA5.0 and DNAMAN. The neighbor-joining (NJ) tree was constructed.The identification competence of psbA-trnH in “Xueteng” herbs was assessed. The results showed that these quence lengths and GC contents of Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis were different.The intraspecific sequences had high similarities, which was higher than its interspecific sequence similarity compared to its adulterants. The minimum interspecific distances of Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis were 0.137, 0.426 and 0.003, respectively. All of them were more than their maximum intraspecific distances,which were 0.014, 0.004 and 0. In NJ tree, Spatholobi Caulis and Sargentodoxae Cauliswere formed into one single branch, which can be clearly distinguished from other adulterants. Kadsurae Caulisand Kadsura heteroclite were formed into one single branch. It was concluded that the psbA-trnH region can accurately distinguish Spatholobi Caulis, Kadsurae Caulis, Sargentodoxae Caulisfrom their adulterants. This DNA barcoding molecular identification method can be used as an effective complement to the traditional identification methods.

psbA-trnH, Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis, DNA barcoding

10.11842/wst.2016.01.007

R931.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-01

＊ 科學技術部“863”計劃（2012AA021602）：基于DNA條形碼的珍稀藥用、野生等資源快速檢測技術及產品研發，負責人：陳士林。

＊＊ 通訊作者：姚輝，副研究員，碩士生導師，主要研究方向：中藥資源與分子鑒定。