固本健腦法對Alzheimer病模型大鼠海馬區樹突棘及P-tau的影響＊

胡玉萍，王 平＊＊，袁德培，朱耀乾，曾楚華

（1.湖北中醫藥大學老年病中藥新產品湖北省協同創新中心 武漢 430065；2.湖北民族學院中醫藥學院 恩施 445000）

固本健腦法對Alzheimer病模型大鼠海馬區樹突棘及P-tau的影響＊

胡玉萍1，王 平1＊＊，袁德培2，朱耀乾2，曾楚華2

（1.湖北中醫藥大學老年病中藥新產品湖北省協同創新中心 武漢 430065；2.湖北民族學院中醫藥學院 恩施 445000）

目的：本課題在成功建立AD大鼠模型基礎上，觀察固本健腦法治療AD的作用及機制。方法：12月齡衰老大鼠行腦立體定位手術于雙側海馬注射Aβ1-42，制備復合AD大鼠模型，并用固本健腦液灌胃干預，以安理申組為對照。4周后，高爾基染色法觀察大鼠海馬區神經元樹突棘形態及密度；Western Blot法檢測大鼠海馬區Caveolin-1、P-tau（Thr231、Ser396位點）蛋白表達改變。結果：高爾基染色法結果顯示：固本健腦液高、低劑量組神經元細胞及樹突棘形態明顯改善，數目及密度顯著增加（P＜0.01）。Western Blot法檢測結果顯示：固本健腦液高、低劑量組可使Caveolin-1的表達不同程度的升高，而tau磷酸化水平下降，差異有顯著性（P＜0.01）。結論：固本健腦法能顯著改善AD大鼠海馬神經元樹突棘形態及密度，顯著提高AD模型大鼠海馬區Caveolin-1的表達，抑制tau蛋白過度磷酸化。

Alzheimer病 固本健腦 樹突棘 Caveolin-1 tau蛋白過度磷酸化

阿爾茲海默病（Alzheimer's Disease，AD）即老年性癡呆，是老年癡呆癥的3大類型之一。tau蛋白異常過度磷酸化已是幾十年來被公認的AD標志性病理特征[1]。課題組在前期研究證實，學習記憶相關蛋白Caveolin-1在AD發病中起著關鍵作用[2]，結合樹突處tau蛋白過度磷酸化對神經元的雙重毒性作用，本課題采用自然衰老大鼠合并雙側海馬區注射Aβ1-42制作復合AD模型，同時給予固本健腦治法方藥進行干預，以西藥鹽酸多奈哌齊（安理申）作為對照；通過高爾基染色法觀察用藥前后模型大鼠海馬區樹突棘形態和密度的改變，采用Western Blot法檢測模型大鼠海馬區Caveolin-1蛋白水平及tau蛋白磷酸化水平，旨在觀察固本健腦法對AD大鼠模型樹突棘及tau蛋白磷酸化的 影響，以探討固本 健腦法治療AD的作用機理。

1 材料

1.1 實驗動物

12月齡清潔級Wistar 大鼠60只，雌雄各半，體質量450±20 g，由湖北省疾病防預控制中心 實驗動物中心提供，動物許可證編號：SCXK（鄂）2008-0005。

1.2 藥物

固本健腦液由湖北民族學院附屬民大醫院制劑室提供。藥物組成：板橋黨參15 g、枸杞15 g、茯苓12 g、酸棗仁15 g、山楂12 g。中藥常規煎煮法，分別制成每毫升含生藥1、2 g兩個劑量；高、低劑量組分別相當于含生藥2、1 g·mL-1。其中低劑量相當于成人用量。

安理申5mg/片[衛材（中國）藥業有限公司，批號：131145A]。取安理申片粉碎后溶于滅菌生理鹽水中，配制成濃度為0.045 mg·mL-1的混懸液，磁力攪拌器攪拌均勻。存于4℃冰箱，備用。

Aβ1-42（美國Sigma公司，批號：107761-42-2）。使用時，將1 mg Aβ1-42溶于200 μL生理鹽水中，混勻離心后封口膜封好，置于數顯恒溫水浴鍋中，37℃孵育72 h，制成聚集態Aβ1-42，終濃度為5 μg·μL-1。存于4℃冰箱，備用。

1.3 試劑

GMS80020.3神經元高爾基染色試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司，批號：1-250029-12）。Western blot試劑盒：Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：P0006）、超敏ECL化學發光試劑盒BeyoECL Plus（碧云天生物技術研究所，批號：P0018）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G2003）、蛋白抽提試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G2001、G2002）；Tween-20（Amresco公司，批號：0777）。抗體：抗P-tau小鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-12414），抗tau兔單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-5587）；內參抗β-actin兔單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-1616r）。二抗：美國KPL公司。青霉素、水合氯醛、無水乙醇、二甲苯等為自配試劑，由實驗室提供。

1.4 實驗儀器

TB-718E石蠟包埋機（泰維科技實業有限公司）；RM2245型半自動輪轉切片機（德國Leica公司）；Eclipse 80i正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；DYY-6C電泳儀、DYCZ-400D轉移電泳儀槽、DYCZ-24DN垂直電泳槽、WD-9405A脫色搖床（北京市六一儀器廠）；2 μL微量進樣器、攪拌器、電子天平等常規器材由實驗室提供。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

將大鼠適應性喂養1周后，隨機分為6組，即正常組、空白對照組、模型組、安理申治療組（簡稱安理申組）、固本健腦液低劑量組（簡稱中低組）、固本健腦液高劑量組（簡稱中高組），每組10只。

2.2 動物造模

大鼠經適應性喂養1周后，除正常組外各組大鼠行腦立體定位手術。大鼠術前禁食12 h，手術前稱重，按照350 mg·kg-1劑量腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，頭項部剪毛備皮，腦立體定位儀固定頭部，常規消毒手術區皮膚，鋪巾，無菌條件下沿顱頂中線做1-2 cm切口，用濕棉球分離骨膜，暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜[3]，定位海馬（以前囟為零點，AP=-4.0 mm，ML=±3.0 mm，DV=4.0 mm），先用牙科鉆顱骨鉆孔，推進微型進樣器注射針，將2 μL濃度為5 μg·μL-1的聚集態Aβ1-42，分別在5 min內緩慢注入雙側海馬，留針5 min，緩慢退針后，以棉簽蘸取少許雙氧水清洗創面，海綿膠貼封顱骨孔，縫合手術切口并涂馬應龍痔瘡膏，肌肉注射青霉素10萬U防感染。手術結束，大鼠撤離手術臺并用神燈照射保暖，待蘇醒后放入籠中常規飼養。空白對照組等位點注入等劑量的生理鹽水，其余操作同上。正常組不予處理。

2.3 給藥方法

手術3天后，中低組、中高組、安理申組大鼠分別按照10 mL·kg-1·d-1劑量每日5：00 p.m.給予相應藥物灌胃，空白對照組、模型組給予等容積的生理鹽水灌胃，連續4周。正常組常規喂養。

2.4 標本制備及檢測指標

2.4.1 大鼠海馬區神經元樹突棘形態學觀察

以10%水合氯醛加倍劑量注射，大鼠深度麻醉后，手術剪剪開胸腔，暴露心臟，從左心室心尖部進針，止血鉗固定針頭，右心耳處開口約0.5-1 cm，快速生理鹽水灌注（大約200 mL/只），直至肝臟變白，右心耳處流出液體澄清。再用4%多聚甲醛連續灌注（約400 mL/只），至大鼠四肢及尾巴、頭頸部變僵硬。大鼠斷頭，冰臺上開顱，快速取出大腦，取左側腦組織海馬部位用刀片自橫斷面切成厚度約5 mm的小塊，含有10 mL Reagent A和10 mL Reagent B的混合液里（20 mL/2塊組織塊），室溫下浸泡孵育2周，避免光照。2周后，取出組織塊，用綿紙吸干，按試劑盒說明書進行高爾基染色，于顯微鏡下觀察并照相。

2.4.2 大鼠海馬區Caveolin-1、P-tau蛋白表達檢測

如上述取腦方法，取大鼠右側大腦海馬組織。Western Blot法檢測大鼠海馬區Caveolin-1、P-tau蛋白的表達：提取大腦海馬總蛋白，Bradford法分標準曲線制作和樣品濃度測定完成蛋白濃度測定；制備SDS-PAGE加樣液，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，行轉膜和封閉；分別用Thr231、Ser396、Caveolin-1蛋白的一抗和二抗進行各自抗體的結合反應，運用化學發光分別檢測Thr231、Ser396、Caveolin-1蛋白表達量，并運用專用的計算機軟件分析量效關系的變化。

2.5 統計學方法

圖1 各組大鼠海馬區神經元樹突棘形態

3 結果

3.1 固本健腦法對AD模型大鼠海馬區神經元樹突棘形態學的影響

參照相關文獻[4]方法，計算各組大鼠海馬區神經元樹突棘密度。選取高倍鏡（400×）下浸染完整的神經元，要求每個樹突至少有1個分支；每個標本、每個區域選擇至少10個神經元做統計，選取神經元最外圍樹突作為測量目標，要求樹突片斷至少10 μm長。在光鏡下選取合適的片段，再在油鏡下拍照。用image-plus 6.0分析軟件測量樹突的長度及樹突棘的數目，以樹突棘數目除以長度所得值計算樹突棘的密度，單位即為樹突棘數目/μm。各組大鼠海馬區神經元樹突棘形態見圖1。各組大鼠海馬神經元樹突棘密度結果，見表1。

正常組大鼠海馬神經元細胞胞體及胞核清晰，樹突棘排列致密（圖1-1）。空白對照組大鼠海馬區神經元細胞未見明顯減少，樹突棘形態尚可，數目及密度與正常組比較無明顯差異（圖1-2）。模型組大鼠海馬區神經元胞體變形，部分神經元消失，胞間間隔增大，細胞體積增大，胞質及胞核染色密度增高，樹突棘數目減少，排列混亂（圖1-3）。安理申組大鼠海馬神經元數目較固本健腦法治療組少，細胞數目有所減少，樹突棘密度較模型組稍好（圖1-4）。固本健腦法低劑量組海馬區神經元未見明顯損害，樹突棘數目及密度接近空白對照組，明顯好于其他治療組（圖1-5）。

由表1數據可以看出，模型組大鼠海馬神經元樹突棘密度減少明顯，與正常組比較，差異有顯著性（P＜0.01）。固本健腦法高、低劑量組大鼠海馬神經元樹突棘密度比模型組、安理申組均增多，有顯著性差異（P＜0.01）。

表1 固本健腦法對AD模型大鼠海馬神經元樹突棘密度的影響（，n=10）

表1 固本健腦法對AD模型大鼠海馬神經元樹突棘密度的影響（，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與安理申組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組Caveolin-1蛋白表達灰度圖

圖3 固本健腦法對AD模型大鼠海馬區Caveolin-1蛋白表達的影響

3.2 固本健腦法對AD模型大鼠海馬區Caveolin-1蛋白表達的影響

采用Western blot技術檢測Caveolin-1蛋白表達情況，Gel-pro軟件測量灰度進行定量分析，實驗重復3次，結果用于統計分析。固本健腦法對AD模型大鼠海馬區Caveolin-1蛋白表達的影響結果見圖2、圖3。

Western blot法檢測結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠海馬區Caveolin-1表達明顯減少（P＜0.01）；經藥物干預后，治療各組藥物均能提高大鼠海馬區Caveolin-1蛋白表達，與模型組比較，差異有顯著性（P＜0.01）；與安理申組對照比較，固本健腦法高、低劑量組有明顯優勢，差異有顯著性（P＜ 0.01）。

3.3 固本健腦法對AD模型大鼠海馬區tau磷酸化的影響

采用Western blot技術檢測蛋白，Gel-pro軟件測量灰度進行定量分析，實驗重復3次，結果用于統計分析。將Thr231、Ser396分別除以總tau作為各個位點相對磷酸化水平，并以正常組的水平標準化為1，用于表示該位點的磷酸化水平。各組大鼠海馬區tau磷酸化水平（Thr231，Ser396位點）及固本健腦法的干預作用結果，見圖4、圖5。

由灰度圖和比值分析可見，Thr231、Ser396兩個位點tau蛋白磷酸化水平比較，模型組與正常組和空白對照組比較，差異明顯（P＜0.01）；經藥物干預后，各治療組與模型組比較，均有顯著改善（P＜0.01）；各治療組中，固本健腦法中高組、中低組與安理申組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

4 討論

課題組根據多年對AD 的理論及臨床研究，認為該病的主要病機為先后天之本（脾腎）虧虛，因虛致實，痰瘀應運而生，蘊于腦竅，致清竅不養或昏蒙；由此認為補益脾腎、固本健腦可作為該病的基本治則治法。依據治則選用湖北恩施傳統出口藥材——中國板黨為主藥，輔以枸杞、茯苓、酸棗仁、山楂等健脾補腎、健腦安神、化瘀藥物組成固本健腦方，并開發為固定院內制劑（名為固本健腦液）。方中板黨健脾培補后天之本，枸杞補腎培固先天之本，是以名之“固本”；棗仁、茯苓補脾腎助本兼養心（腦）安神之功故名“健腦”；山楂消積化瘀以為諸藥之佐使。全方以“固本健腦”為治則治法，彰顯補腎健脾固本、健腦促智安神之功。自20世紀90年代開始用于臨床，至今20 余年，得到醫患的一致肯定。臨床資料表明其對中醫辨證之衰老見證積分值有明顯改善作用，且未見毒副作用，是為防治AD 效果顯著的方藥。

tau蛋白正常表達是人體所必需，其參與維持細胞正常形態、信息傳遞、細胞分裂及運動等重要生物學過程[5，6]。tau蛋白二級結構疏松，在聚合誘導因子和翻譯后修飾（主要是磷酸化）作用下形成β折疊結構，此時tau與微管分離失去生理作用，并逐步聚集成tau蛋白二聚體、寡聚體、雙股螺旋形神經絲（Paired Belical Filament，PHF）和神經原纖維結（Neurofibrillary Tangles，NFT）。tau蛋白磷酸化與去磷酸化機制的失衡導致tau蛋白過度磷酸化，過度磷酸化的tau蛋白在細胞內相互聚集形成PHFs，這將直接導致微管穩定性下降，軸突運輸障礙，神經元變性、凋亡，AD發生[7]。Bi M.等[8，9]人研究發現，在沒有明顯的Aβ沉積時就有tau病理發生，并且降低tau基因敲除小鼠的tau蛋白水平能夠阻止Aβ的毒性。另有研究稱tau蛋白的關鍵蛋白激酶GSK-3β能夠磷酸化胞內域的淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Protein，APP），而有效抑制Aβ的生成[10]。換言之，tau過度磷酸化是AD病理改變的源始因素，且從抑制tau磷酸化角度治療AD亦能有效阻止AD另一重要病理改變Aβ的生成，從而起到更好的作用。

樹突棘密度、形態在接受傳導信息過程中起重要作用，因此，學習記憶的形態學基礎和關鍵可能就在樹突棘[11]。眾多新發現tau蛋白在軸突與微管發生重要作用，而在樹突處介導Aβ的毒性作用[12，13]。樹突處存在的tau蛋白過度磷酸化一方面會直接引起病理改變使神經元病變，同時還會加劇Aβ對神經元的毒性作用，從而對神經元雙重傷害。研究報道，AD患者神經元樹突處大量聚集tau蛋白，通過與賴氨酸蛋白激酶（Fyn）發生作用將Fyn轉移至樹突端，Fyn可促使突觸后密度蛋白95 （Postsynaptic Density Protein，PSD95） 與 NMDA受體作用進而介導Aβ誘導的興奮毒性作用，抑制過度磷酸化tau蛋白，可以減弱這種毒性作用[14]。另一方面，從形態學上看，樹突棘處多發tau蛋白過度磷酸化，會使樹突棘丟失或形態發生改變，直接導致神經元突觸功能損害，進而出現學習記憶能力的改變，誘發AD[15，16]。

有研究顯示Caveolin-1能夠調節tau蛋白、Aβ、NMDA和AMPA的表達，Head B.P.等[17]發現Caveolin-1基因敲除小鼠表現出類似AD海馬區的病理改變，即tau蛋白異常過度磷酸化，Aβ表達增加，將敲除Caveolin-1后的神經元細胞體外培養后再轉染Caveolin-1質粒，結果顯示Aβ表達顯著降低。Francesconi A.等[11，18]國內外研究先后通過實驗發現通過調節Caveolin-1能影響NMDA/AMPA受體通道從而增強突觸的傳遞效率、并改善樹突棘的形態結構和促進新棘的形成，進而使長時程增強維持和表達增強，改善認知及學習記憶能力。

圖4 各組Thr231、Ser396位點蛋白表達灰度圖

圖5 固本健腦法對AD模型大鼠海馬區tau蛋白過度磷酸化的影響

結合以上研究成果，我們設想，Caveolin-1蛋白水平與tau蛋白過度磷酸化、樹突棘形態及密度密切相關。本實驗研究結果顯示，模型組大鼠海馬區Thr231、Ser396兩個位點tau蛋白磷酸化水平顯著升高；經固本健腦法及安理申等藥物干預后，治療各組大鼠海馬區tau蛋白過度磷酸化水平顯著下降。加之學習記憶行為學和樹突棘形態學的結果和課題組前期研究成果，我們可以得出結論，以培固先后天之本、健腦益智為治則治法組成的固本健腦液是治療老年性癡呆的有效方劑。固本健腦液能夠有效調控AD模型大鼠海馬區Caveolin-1蛋白表達水平，并通過調控Caveolin-1水平，抑制tau蛋白過度磷酸化，從而保護樹突棘形態及密度，增強學習記憶能力，預防和治療AD。

1 Liao K, Liu D, Zhu L Q. Enriched odor exposure decrease tau phosphorylation in the rat hippocampus and cortex. Neurosci Lett, 2012, 507(1)： 22-26.

2 袁林.固本健腦法對MCI大鼠學習記憶能力及海馬Caveolin-1的影響.武漢:湖北中醫藥大學博士學位論文, 2011： 42-50.

3 王述菊,孫國杰,馬駿,等.艾灸對Alzheimer病模型大鼠行為學及海馬區Bcl-2、Bax、Caspase-3影響的研究.世界科學技術-中醫藥現代化, 2015, 17(6)： 1243-1248.

4 賈賀,張博愛,劉宇,等.慢性腦缺血大鼠海馬CA1區錐體細胞樹突形態及樹突棘密度的變化.中國病理生理雜志, 2012, 28(1)：177-180.

5 單守勤,趙權,張立營,等.阿爾茨海默病患者的腦脊液tau蛋白及Aβ1-42水平.中國神經精神疾病雜志, 2011, 37(11)： 691-693.

6 Sperling R. Functional MRI studies of associative encoding in normal aging，mild cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Ann NY Acad Sci, 2007, 1097(2)： 146-155．

7 劉曉燕,張志珺. Tau蛋白在阿爾茨海默病中的研究進展.中華腦血管病雜志, 2011, 5(5)： 411-416.

8 Bi M, Ittner A, Ke Y D, et al. Tau-targeted immunization impedes progression of neurofibrillary histopathology in aged P301L tau transgenic mice. PLoS One, 2011, 6(12)： e26860.

9 Ittner L M, Ke Y D, Delerue F, et al. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell, 2010, 142(3)： 387-397.

10 Saeki K, Machida M, Kinoshita Y, et al. Glycogen synthase kinase-3β2 has lower phosphorylation activity to Tau than glycogen synthase kinase-3β1. Biol Pharm Bull, 2011, 34： 146-149.

11 宮曉洋,戰麗彬,隋華,等.滋補脾陰方藥對脾陰虛癡呆大鼠腦內NMDA受體mRNA表達的影響.世界科學技術-中醫藥現代化, 2015, 17(6)： 1235-1242.

12 Hoover B R, Reed M N, Su J, et al. Tau mislocalization to dendritic spines mediates synaptic dysfunction independently of neurodegeneration. Neuron, 2010, 68(6)： 1067-1081.

13 Spires-Jones T, Knafo S. Spines, plasticity, and cognition in Alzheimer's model mice. Neural Plast, 2012, 2012： 319836.

14 Ittner L M, G?tz J. Amyloid-β and tau——a toxic pas de deux in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci, 2011, 12(2)： 65-72.

15 曲敏. EphB2受體在阿爾茨海默病模型小鼠的表達差異及其對tau蛋白磷酸化的影響和機制.武漢:華中科技大學博士學位論文, 2011, 5： 55-58.

16 Kremer A, Maurin H, Demedts D, et al. Early improved and late defective cognition is reflected by dendritic spines in Tau. P301L mice. J Neurosci, 2011, 31(49)： 18036-18047.

17 Head B P, Peart J N, Panneerselvam M, et al. Loss of Caveolin-1 accelerates neurodegeneration and aging. PLoS One, 2010, 5(12)： e15697. 18 Francesconi A, Kumari R, Zukin R S, et al. Regulation of group I metabotropic glutamate receptor trafficking and signaling by the caveolar/lipid raft pathway. J Neurosci, 2009, 29(11)： 3590-3602.

Effect of Gu-Ben Jian-Nao Recipe on Dendritic Spines and P-tau in Hippocampus of Alzheimer's Disease Rat Model

Hu Yuping1, Wang Ping2, Yuan Depei2, Zhu Yaoqian2, Zeng Chuhua2
(1. New Products of Traditional Chinese Medicine Senile Diseases Co-innovation Center of Hubei, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2. School of Traditional Chinese Medicine, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

Based on the successful establishment of Alzheimer's disease (AD) rat model, the effects and mechanisms of Gu-Ben Jian-Nao (GBJN) recipe in AD treatment were investigated. The compound AD rat model was prepared with the operation of bilateral hippocampal injection of Aβ1-42on 12-month aged rats. And then, intragastric administration of GBJN liquid was given to the rat model. Aricept was used as control. After 4 weeks, Golgi staining was used to observe the morphology and density of dendritic spines of neurons in the hippocampus of rats. Western blot was used in the detection of changes of Caveolin-1, P-tau (Thr231, Ser396 sites) protein expressions in the hippocampus of rat. The results of Golgi staining showed that both the high and low dose GBJNiquid group can obviously improve the morphology as well as significantly increase the amount and density of dendritic spines of neurons (P ＜ 0.01). Western blot results showed that both the high and low dose GBJN liquid group can increase the Caveolin-1 expression at different degrees, but the tau phosphorylation level decreased, with significant differences (P ＜ 0.01). It was concluded that GBJN recipe can obviously improve the morphology and density of dendritic spines of neurons in the hippocampus of AD rats, significantly increase the Caveolin-1 expression in the hippocampus of AD rats, and inhibit the excessive phosphorylated tau protein.

Alzheimer's disease, Gu-Ben Jian-Nao, dendritic spines, Caveolin-1, excessive phosphorylated tau protein

10.11842/wst.2016.01.009

R277.7

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-09-06

修回日期：2015-10-28

＊ 湖北省衛生廳青年人才項目（QJX2012-18）：固本健腦液對AD模型大鼠海馬區樹突棘、Caveolin-1、P-tau的影響，負責人：胡玉萍；國家自然科學基金青年科學基金項目（81503484）：固本健腦法對Alzheimer病細胞模型Sorla阻斷APP裂解通路機制的調節作用研究，負責人：胡玉萍。

＊＊ 通訊作者：王平，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫衰老理論及老年腦病的證治規律研究。