穿心蓮內酯的提取及其衍生物的制備工藝

李玉山

（西安佳德生物工程有限公司 西安 710075）

穿心蓮內酯的提取及其衍生物的制備工藝

李玉山＊

（西安佳德生物工程有限公司 西安 710075）

目的：提取純化穿心蓮內酯及制備其衍生物。方法：通過對川產穿心蓮提取工藝的比較研究，以乙醇濃度、提取溫度、料液比為影響因素，采用球面對稱設計優化了提取工藝，根據穿心蓮內酯理化性質，設計出最優純化工藝路線，得到穿心蓮內酯精品；蓮必治的制備主要考察了物料比和反應液酸堿度的影響；喜炎平的制備主要對純化工藝進行了優化；穿琥寧的制備以原料配比、溶劑用量、反應溫度和時間為影響因素，采用L9（34）正交設計優化了最佳合成工藝；炎琥寧的制備以穿琥寧為原料，以溶液酸堿度、反應溫度和時間為影響因素，采用均勻設計優化了合成工藝。結果：穿心蓮最佳提取工藝為：90%的乙醇以4倍（mL·g-1）的料液比，在65℃下提取，在此工藝下穿心蓮內酯的得率為21.5%，含量為17.8%；蓮必治的制備中，穿心蓮內酯與亞硫酸氫鈉質量比為1：1.8為宜，反應液pH值控制在8反應很完全；喜炎平的制備反應中應控制好濃硫酸的加入速度，磺化反應后以無水乙醇除鹽；最佳工藝條件下穿琥寧得率為130.6%，含量為99.2%；炎琥寧在最佳工藝條件下得率為98.2%，含量為98.6%。結論：在提取純化穿心蓮內酯的基礎上，制備了穿心蓮內酯的內酯系列衍生物，工藝穩定可行，為綜合利用穿心蓮提供依據。

穿心蓮內酯 提取純化 蓮必治 喜炎平 穿琥寧 炎琥寧

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andjrographis panicalata （Burmf） Ness的草或葉。穿心蓮中含有多種二萜類化合物，主要包括穿心蓮內酯（穿心蓮乙素）、脫水穿心蓮內酯（穿心蓮丁素）、脫氧穿心蓮內酯（穿心蓮甲素）、新穿心蓮內酯（穿心蓮丙素）、高穿心蓮內酯等多種苦味素成分，其中，抗菌消炎的主要成分為穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯，穿心蓮全草可入藥，具有清熱解毒、消炎涼血止腫的功效[1]，被廣泛應用于腸胃炎、肺炎、中耳炎、支氣管炎、痢疾、咽喉炎、外傷感染、水火燙傷、蛇毒咬傷、尿路感染、風熱感冒、扁桃體炎、陰囊濕癥、痛癤皰瘍等的治療[2]，被譽為“天然廣譜抗生素藥物”，臨床應用廣泛。穿琥寧化學名稱為“14-脫羥11，12-二脫氫穿心蓮內酯-3，19-二琥珀酸半酯單鉀鹽”，具有解熱、抗炎、鎮靜、增加機體對病原體感染的應急等能力，對流感病毒甲Ⅰ型和甲Ⅲ型、肺炎腺病毒Ⅲ型和Ⅳ型、腸合胞病毒及呼吸道合胞病毒均有滅活作用。炎琥寧由穿心蓮內酯經酯化、脫水、成鹽精制而成，化學名稱為“14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內酯-3，19-二琥珀酸半酯鉀鈉鹽”，可抑制毛細血管通透性增高、炎性滲出以及水腫，興奮垂體-腎上腺皮質，促進促腎上腺皮質激素（Adrencorticotropic Hormone，ACTH）釋放，增加ACTH的生物合成，體外具有滅活腺病毒、流感病毒、呼吸道病毒等多種病毒的作用。關于穿心蓮內酯的提取，文獻[3-7]報道較多，有純水提取、酸水或堿水提取、乙醇提取、微波輔助提取、超聲提取、超臨界二氧化碳萃取。用乙酸乙酯為溶媒，提取物純度僅45%，穿心蓮內酯不溶于水，不適合用純水提取；堿水提取率最高，但內酯成分易被堿水破壞；微波輔助酸堿法提取雖時間短，但微波法在生產中應用不便，只局限于試驗室中；超聲輔助提取和微波法相同，在工業化生產中應用受限。因此，最好的提取法是甲醇或乙醇提取，本研究則采用乙醇提取。穿心蓮內酯的提取文獻報道較多，但都只是做了粗提物，對后序的分離純化報道很少，而且報道的工藝存在很多不足之處，不利于工業化生產。本文對穿心蓮內酯的提取以球面對稱設計進行優化，得到最佳工藝，尤其是利用穿心蓮內酯二萜類化合物的理化性質，進行了較為簡捷合理的分離純化，設計了最佳分離純化工藝，以期為工業化生產提供有效的指導。蓮必治具有抗病毒、抗菌消炎、退熱、抗腫瘤、調節免疫等功能，而喜炎平、穿琥寧、炎琥寧的合成文獻報道很少。柏俊等[8]對炎琥寧的合成進行了研究，但需在充氮氣條件下進行，實際生產有諸多不便，且收率只有80.6%，含量為97.8%，都不高。姚剛等[9]對炎琥寧的合成進行了研究，改變了投料比、反應時間，控制了成鹽的酸堿度，但總收率只有78.0%，含量97.95%。朱仁發等[10]對蓮必治的合成工藝進行了研究，以亞硫酸氫鈉為試劑，總收率為81.3%，含量99.6%。因此，本研究在得到穿心蓮內酯最佳提取工藝的基礎上，進一步對其衍生物的合成作了初步探索。

1 試驗部分

1.1 材料與儀器

琥珀酸酐、吡啶、無水乙醇、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、濃硫酸均為分析純。

層析硅膠G（青島海洋化工廠）；BS1101型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；HH-Z數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器公司）；R-201旋轉蒸發器（上海申科機械研究所）；101-Z-BS電熱鼓風干燥箱（上海躍進醫療儀器廠）；UV5500紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；2010A高效液相色譜儀（日本島津）。

穿心蓮由西安佳德生物工程有限公司質量總監汪洋鑒定為爵床科植物穿心蓮Andjrographis panicalata （Burmf） Ness全草。

1.2 檢測方法

穿心蓮內酯、水溶性穿心蓮內酯、穿琥寧、炎琥寧檢測方法參照文獻報道方法[11-14]。

1.3 穿心蓮內酯的提取

穿心蓮內酯以乙醇提取，選取影響因素為乙醇濃度（X1）、提取溫度（X2）、料液比（X3），以實際得率（收率與含量的乘積）為考察目標，進行球面對稱設計優化提取工藝，因素水平見表1。

表1 因素水平

圖1 穿心蓮內酯提取純化工藝流程圖

1.4 穿心蓮內酯的純化

1.4.1 穿心蓮內酯的脫脂

穿心蓮提取減壓后的濃縮液以等量石油醚（60-90℃）萃取脫脂，石油醚合并回收，脫脂液在663 nm和645 nm紫外波長下測定OD值以鑒別脫脂效果。

1.4.2 穿心蓮內酯的分離

上述脫脂液以氯仿萃取，棄去氯仿層（含脫氧穿心蓮內酯），收集水液，結晶，過濾，得到穿心蓮內酯粗品。

1.4.3 穿心蓮內酯的精制

乙酸乙酯、丙酮兩種試劑分別處理。取等量的兩份穿心蓮內酯粗品，分別用乙酸乙酯和丙酮加熱回流，直至檢查殘渣中無有效成分為止，將提取液濃縮，脫色，放置，結晶。

1.5 蓮必治的制備

穿心蓮內酯以乙醇溶解，加入亞硫酸氫鈉水溶液，加熱回流反應30 min，濃縮反應液得黏稠狀物，黏稠物以水溶解后，放涼過濾去除不溶物后，濾液以乙酸乙酯萃取3次，水液減壓濃縮至干，加入乙醇熱溶后，加少量活性炭脫色，過濾，濾液濃縮，放置結晶，反應式見圖2。

1.6 喜炎平的制備

穿心蓮內酯加入冰醋酸，再加醋酐，于室溫滴加濃硫酸反應，冷卻降溫，收集沉淀，水洗，干燥，溶解，加入活性炭脫色，過濾，濃縮，結晶，得白色穿心蓮內酯磺酸鈉，反應式見圖3。

1.7 穿琥寧的制備

穿心蓮內酯與丁二酸酐反應，得脫水穿心蓮內酯丁二酸半酯，然后再與碳酸氫鉀 反應得穿琥寧。以原料比、溶劑用量、反應溫度和反應時間為影響因素，以穿琥寧的得率為考察目標，利用正交設計優化最佳合成工藝，反應式見圖4。

采用L9（34）正交表，以原料比（A）、溶劑用量（B）、反應溫度（C）、反應時間（D）為4個考察因素，選取3個水平進行試驗。

1.8 炎琥寧的制備

以穿琥寧為原料，與碳酸鈉反應制得炎琥寧。以溶液pH值、反應溫度和反應時間為影響因素，以炎琥寧的得率為考察目標，利用均勻設計優化最佳合成工藝，反應式見圖5。

采用U7（76）均勻設計，選取影響因素較大的溶液pH值（X1）、反應溫度（X2）、反應時間（X3）為考察因素，進行了3因素7水平均勻設計試驗，因素水平見表3。

圖2 蓮必治的合成

圖3 喜炎平的合成

圖4 穿琥寧的合成

2 結果與討論

2.1 穿心蓮內酯的提取

球面對稱設計結果見表4。

由表4可知，當乙醇濃度為90%，料液比為1：15，提取溫度為60℃，穿心蓮內酯的得率最高為5.2%。由于穿心蓮內酯類化合物不溶于水，易溶于乙醇、甲醇等極性溶劑，故以乙醇提取。球面對稱設計以球面設計為基礎，以試驗所考察的影響因素的個數為空間維度，以因數個數的平方根為球半徑，具有試驗次數少、精度高、成本低的特點，是一種比較流行的試驗設計方法。相比較正交設計、均勻設計和效應面設計等方法，得到的關系式可確定任何在范圍內的試驗點的預測值，缺點是設計復雜，需豐富的專業知識確定各因素的范圍，要求較高。乙醇提取時酒精度過高，葉綠素、色素等會大量被提取出，酒精度過低，穿心蓮內酯類化合物又不能很好地提取，本試驗優化的乙醇濃度為90%。文獻報道的有純水、酸水、堿水提取，但由于穿心蓮內酯的特殊內酯結構及水溶性差的性質，對酸、堿、高溫都比較敏感，導致這3類溶劑提取收率都極低或內酯結構遭到破壞，其中，堿水提取法已被1990版《中國藥典》淘汰，無實際應用價值。本研究以乙醇提取，工藝過程不產生有害物質，所用乙醇回收利用，可實現清潔生產。

2.2 穿心蓮內酯的純化

結果見表5、表6。

由表3可見，石油醚萃取3次可有效去除色素，故本研究以60-90℃石油醚等體積萃取3次。所有的文獻報道中對葉綠素采用的都是提取、濃縮、結晶或是樹脂吸附等方法，都未能有效地除去提取液中的大量葉綠素，導致后續分離純化效果不佳。直接濃縮后的穿心蓮內酯含有較多雜質，顏色較深，必須經過脫脂去除色素才能得到色澤良好的產品，而且也有利于結晶。本工藝在提取、濃縮后用石油醚萃取色素，利用穿心蓮內酯與脫氧穿心蓮內酯在氯仿中溶解度不同而分離。氯仿溶解液濃縮至干，加入乙醇和活性炭脫色，過濾。濾液放置，析出新穿心蓮內酯，結晶母液回收至干，以苯提取，得到脫氧穿心蓮內酯。

由表4可知，穿心蓮粗結晶以氯仿溶解除去脫氧穿心蓮內酯，過濾所得的固形物為穿心蓮內酯，再以乙酸乙酯溶解，結晶較好，所用溶劑少，結晶物收率高。

2.3 蓮必治的制備

蓮必治為穿心蓮內酯與亞硫酸氫鈉加成反應反應的產物。配料比和反應液pH對合成的影響見表7。

由表7可知，本反應穿心蓮內酯與亞硫酸氫鈉質量比為1：1.8為宜，反應液pH值控制在8反應很完全。理論上摩爾比為1：1，故10 g穿心蓮內酯只需2.97 g亞硫酸氫鈉。由于亞硫酸氫鈉性質不穩定，實際中配成水溶液來使用，而且反應中需稍微多加一點以利于穿心蓮內酯的反應。反應物傳統上用氯仿去除雜質，但實際上無法徹底，因氯仿極性較低，本研究以乙酸乙酯代替氯仿效果很好，而且毒性很低。反應中亞硫酸氫鈉與反應液的pH值相關，控制好亞硫酸氫鈉的加入量對反應影響較大。

2.4 喜炎平的制備

穿心蓮內酯與濃硫酸發生磺化反應后與鈉離子成鹽生成的水溶性產物，理論上摩爾比為1：1，反應溫度、時間對反應影響較大。天然產物中許多不溶于水的化合物為了增加水溶性，通常采用環糊精包合或磺化成鹽，環糊精包合法生成的產物水溶性不理想，故本文利用磺化反應成鹽大大增加了水溶性。穿心蓮內酯加入無水乙醇加熱溶解，滴加濃硫酸，室溫反應，反應液中加入亞硫酸鈉液，析出穿心蓮內酯磺酸鈉，過濾，以飽和氯化鈉洗滌，干燥，以無水乙醇熱溶后，加入活性炭脫色，過濾，濃縮，結晶，得白色穿心蓮內酯磺酸鈉。反應中應控制好濃硫酸的加入速度，加入過快易炭化，生成的穿心蓮內酯磺酸鈉在強酸性溶液中，用飽和氯化鈉洗滌殘留的酸液，得到的粗品含有大量的氯化鈉。本文將粗品干燥后，以無水乙醇溶解，可有效除去氯化鈉，得到的濾液脫色，結晶，得到純品喜炎平。

表2 穿琥寧制備工藝L9（34）正交試驗因素水平

圖5 炎琥寧的合成

表3 U7（76）均勻設計

表4 球面對稱設計結果

表5 萃取次數與OD值（663 nm）關系

表6 兩種溶劑處理效果

表7 蓮必治合成影響因素

表8 L9（34）試驗方案及結果

2.5 穿琥寧的制備

2.5.1 正交試驗

結果見表8。

根據表8極差分析可以看出，其影響順序為RA＞RD＞RC＞RB。4個因素對穿琥寧合成得率影響大小依次為：原料比（A）＞反應時間（D）＞反應溫度（C）＞溶劑用量（B）。4因素中，原料比和反應時間的影響較為顯著，其中，原料比的影響最為顯著。在試驗設計范圍內，優化得到的最佳制備工藝條件為：A2B2C1D3，即原料比為0.8：1、溶劑用量為600 mL、反應溫度為45℃、反應時間10 h。穿琥寧為脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯單鉀鹽（PDS），具抗菌消炎、清熱解毒、抗病毒性肝炎、抗病毒性上呼吸道感染及急性細菌性痢疾的功效。

2.5.2 驗證試驗

按照A2B2C1D3進行3次平行試驗，穿琥寧的得率平均值為130.6，高于表6每一項試驗結果，故A2B2C1D3為穿琥寧的最佳制備工藝條件。

2.6 炎琥寧的制備

2.6.1 均勻設計

以炎琥寧的得率和含量作為評價指標，同時參考炎琥寧總有效成分含量，采用U7（76）均勻設計篩選合成最佳工藝條件，結果見表9。

求得逐步回歸方程，根據各回歸方程的回歸系數、F值及其顯著性檢驗，結合試驗原理和經驗，選出優化方程為：Y=1 291.465-181.84X1＋9.562X2-23.21X1×X3-0.632X1×X3，最高指標時各個因素組合：X1=8.0，X2=40，X3=8.0；顯著水平P=0.026，統計量值F=16.4，相關系數R=0.992 0，調整后的相關系數R=0.979 5，表明方程擬和度良好，因素顯著。由上述數據得最佳合成工藝為：溶液pH值8.0、反應溫度40℃、反應時間8.0 h。由于穿琥寧制備炎琥寧的影響因素較簡單，只考慮試驗點在試驗范圍內的均勻散布，均勻設計要求的試驗數較少，對于因素的水平較多時，正交試驗的試驗數太多，而均勻試驗可很好解決這一問題。本試驗影響因素較少，但水平較多，故采用均勻設計。

2.6.2 驗證試驗

以穿琥寧為原料，與碳酸鈉反應，調節溶液pH8.0，在40℃下反應8.0 h，炎琥寧的得率為98.2，含量為98.6，總有效成分含量為96.8，較前7次的試驗結果都要好，驗證結果與均勻設計預測結果基本接近，表明該合成工藝可行。

3 結論

穿心蓮是爵床科植物，為可再生資源，生長于濕熱的平原和丘陵地區，在長江南北均有種植，是一種用途極廣的中藥。近年來，對穿心蓮的研究較多，但都只側重于某一方面，對穿心蓮甲、乙、丙、丁素的綜合提取還未見報道。本文對其綜合提取進行了研究，采用乙醇提取、石油醚脫脂、結晶物氯仿提取，得到穿心蓮甲素和丙素，殘余物以乙酸乙酯提取得到穿心蓮乙素，殘留物為穿心蓮丁素。關于蓮必治、喜炎平、穿琥寧和炎琥寧的合成，本文進行了詳細的研究，得到了適合工業化生產的最佳工藝，為傳統中藥穿心蓮更深入地研究提供參考。

表9 U7（76）均勻設計結果

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Preparation Technology on Extraction of Andrographolide and Its Derivatives

Li Yushan
(Xi'an Jia De Biological Engineering Co. Ltd., Xi'an 710075, China)

This study was aimed to extract and purify andrographolide an d its derivatives. Comparative extraction technology was performed on the extraction of andrographolide in Sichuan province. Main influencing factors were ethanol concentration, extraction temperature and feed-to-liquid ratio. Spherical symmetric design was used in the optimization of extraction technology. According to the physiochemical characteristics of andrographolide, the optimum purification technology was designed for the best quality andrographolide. The preparation of Lian-Bi-Zhi (LBZ) mainly investigated the influencing factors of feed-to-liquid ratio and alkalinity acidity of reactionliquid. The preparation of Xi-Yan-Ping (XYP) mainly optimized the purification technology. The preparation of Potassium Dehydroandrographolide Succinate took raw material proportion, solvent amount, reaction temperature and time as influencing factors. The L9(34) orthogonal design was used to optimize the best synthesis process. The preparation of Potassium Sodium Dehydroandrographolide Succinate used Potassium Dehydroandrographolide Succinate as material. The solution alkalinity acidity, reaction temperature and time were influencing factors. Uniform design was applied in the optimization of synthesis process. The results showed that the best extrac tion technology of Herba Andrographitis was 90% ethanol (mL·g-1) with 4-fold feed-to-liquid ratio, extraction at 65℃. Under this extraction technology, the yield of andrographolide was 21.5% with the content of 17.8%. The appropriate weight ratio between andrographolide and sodium hydrogen sulfite was 1：1.8 for the preparation of LBZ. The pH value of reaction liquid should be at 8. In the preparation of XYP, the adding speed of concentrated sulfuric acid should be controlled. After sulfonation reaction, absolute ethyl alcohol was used in the desalination. Under the optimized technological conditions, the yield of Potassium Dehydroandrographolide Succinate was 130.6% with the content of 99.2%; the yield of Potassium Sodium Dehydroandrographolide Succinate was 98.2% with the content of 98.6%. It was concluded that based on the extraction and purification of andrographolide, the preparation technology of its derivatives was stable and practical, which provided evidences for the comprehensive using of Herba Andrographitis.

Andrographolide, extraction and purification, Lian-Bi-Zhi, Xi-Yan-Ping, Potassium Dehydroandrographolide Succinate, Potassium Sodium Dehydroandrographolide Succinate

10.11842/wst.2016.01.016

TQ351.0

A

（責任編輯：劉馨雨 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-08-10

修回日期：2015-09-15

＊ 通訊作者：李玉山，主要研究方向：天然藥物化學研究。