荔枝核總黃酮對肝纖維化大鼠模型PPARγ/c-Ski表達的影響＊

康 毅，羅偉生，黃 紅，黃旭平，張揚武，黃 瑞，譚全肖

（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一臨床醫學院 南寧 530001）

荔枝核總黃酮對肝纖維化大鼠模型PPARγ/c-Ski表達的影響＊

康 毅1，羅偉生2＊＊，黃 紅2，黃旭平2，張揚武2，黃 瑞2，譚全肖2

（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一臨床醫學院 南寧 530001）

目的：本研究主要觀察荔枝核總黃酮（TFL）對二甲基亞硝胺（DMN）誘導的肝纖維化大鼠的防治效果，并從PPARγ、c-Ski等信號分子角度探討TFL抗肝纖維化的作用機制。方法：90只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、TFL（高、中、低）劑量組和秋水仙堿陽性對照組，每組15只。空白對照組不造模，其余各組按2 mL·kg-1腹腔注射0.5%的DMN溶液制作肝纖維化模型（生理鹽水稀釋，每周前3天，共4周）；造模同時TFL高、中、低劑量組分別以TFL 200、100、50 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，秋水仙堿組以秋水仙堿0.1 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共6周（上述灌胃藥物均用適量生理鹽水配置成混懸液）；6周末處死大鼠，腹主動脈真空負壓采血檢測天冬氨酸 轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、轉化因子-β1（TGF-β1）血清水平；Masson染色法觀察大鼠肝纖維化程度，并進行肝纖維化半定量評分；運用免疫組化檢測各組肝組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、氧 化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）和c-Ski的蛋白相對表達水平。結果：與空白對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TGF-β1水平、肝纖維半定量評分和 肝組織α-SMA蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；PPARγ和c-Ski蛋白相對表達明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，荔枝核總黃酮各組血清AST、ALT、TGF-β1水平、肝纖維半定量評分和肝組織α-SMA蛋白表達均明顯減少（P＜0.05）；肝組織PPARγ、c-Ski的蛋白相對表達明顯增加（P＜0.05），且具有一定量效關系。結論：TFL能夠有效地降低DMN誘導的肝纖維化大鼠的肝損傷，改善其肝纖維化的程度；其抗肝纖維化的作用機制可能是通過上調PPARγ/c-Ski表達，下調α-SMA和TGF-β1表達，抑制肝星狀細胞活化來實現。

肝纖維化 荔枝核總黃酮 α-平滑肌肌動蛋白 轉化因子-β1 過氧化物酶體增殖物活化受體γ c-Ski

肝纖維化是在各種肝損因素持續作用下，肝細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）異常增多和降解不足，引起肝臟組織結構及功能異常的病理變化。肝纖維化如果得不到 控制而持續進展，最終會發展成為肝硬化，并會產生多種危及生命的并發癥，如：肝功能衰竭、肝性腦病、肝癌等[1，2]。目前研究認為，肝纖維化乃至早期肝硬化均是可逆的[3]，肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）的活化和增值為肝纖維化發生和發展的中心環節[1，4]。過氧化物酶體增殖物活化受體γ（Peroxisome Proliferatorsactivated Receptor γ，PPARγ）可影響HSC的活化，延緩肝纖維化的形成，并與多條信號通路交聯介導肝纖維化的轉歸[5]。TGF-β/Smads信號通路在肝纖維化啟動、進展乃至肝硬化形成中發揮核心作用，活性蛋白c-Ski是TGF-β/Smads信號通路中的阻遏子[6]。PPARγ活化后對c-Ski始發于轉錄水平的上調，提示c-Ski可能是PPARγ的又一靶基因[7]。

荔枝核味甘、微苦，歸肝、腎經，具有行氣散結、祛寒止痛的功效。荔枝核總黃酮（Total Flavone from Litchi Chinensis Sonn.，TFL）為荔枝核中有藥理活性的主要成分之一，本課題組前期研究已證TFL具有抗肝纖維作用[8-10]。本課題通過動物大鼠實驗，從血清水平、病理形態學角度驗證TFL抗肝纖維化效應，并采用酶聯免疫吸附法（ ELISA）檢測血清TGF-β1水平，免疫組化技術檢測PPARγ、c-Ski和α-SMA的表達情況，探討TFL抗肝纖維化的可能細胞分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠90只，體質量150±20 g，鼠齡5周，由廣西醫科大學動物中心提供，合格證：SCXK桂2009-0002。

1.2 試劑和儀器

TFL，純度為82.1%（南京澤朗醫藥科技有限公司，批號：ZL131022300YY）；秋水仙堿片，規格：0.5 mg/片（西雙版納版納藥業有限責任公司，批號：130323）；DMN，規格：1 g·mL-1（美國Sigma公司產品），由桂林醫學院科學實驗中心友好提供；兔抗鼠PPARγ多克隆抗體（美國Abcam公司，批號：GPV1432），兔抗鼠c-Ski多克隆抗體（美國Abcam公司，批號：GSC1422）；兔抗鼠α-SMA多克隆抗體（武漢三鷹公司，批號：14395）；TGF-β1 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：2271145327），DAB顯色試劑盒、免疫組織化學二抗試劑（福建邁新公司）；全自動生化分析儀7600-020（日本HITACHI公司）；倒置照相顯微鏡CK2（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模

90只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組、TFL高劑量組、TFL中劑量組、TFL低劑量組，每組15只。空白對照組不予處理。參照Ala-Kokko等[11]方法腹腔注射2 mL·kg10.5%DMN，每周3天，連續4周，制作肝纖維化模型。造模當日即開始分組給藥，空白對照組、模型組按5 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，荔枝核總黃酮按高、中、低劑量組分別按生藥計算為200、100、50 mg·kg-1·d-1灌胃，秋水仙堿組按0.1 mg·kg-1·d-1秋水仙堿灌胃，灌胃藥物均用適量生理鹽水配制成混懸液，每日1次，共給藥6周。參考覃浩等[10]《荔枝核總黃酮預防大鼠肝纖維化的初步研究》。

1.3.2 肝功能及TGF-β1檢測

血液常規離心分離出血清后，采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清TGF-β1水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 Masson染色

實驗結束后處死大鼠，取肝右葉中部組織用4%的多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，進行Masson染色。肝纖維化分級評分參照2002年中華肝臟病學會肝纖維化分級法[12]。

1.3.4 免疫組織化學染色檢測α-SMA 、PPARγ、c-Ski蛋白表達

肝 組織防脫切片經過常規脫蠟、脫水；2% EDTA抗原熱修復20 min，PBS沖洗；3% H2O2阻斷10 min，PBS沖洗；分別滴加α-SMA、PPARγ、c-Ski多克隆抗體（按說明書預先稀釋），孵育1 h后PBS沖洗；滴加二抗，孵育20 min，然后PBS沖洗；DAB顯色；蘇木精復染，脫水，透明，封片、光學顯微鏡下觀察。參照徐列明等[13]免疫組化顯色評分標準進行評分。

1.4 統計學 分析

2 結果

2.1 基本實驗情況

實驗過程中共死亡3只大鼠，其中秋水仙堿組死亡1只，模型組死亡2只。秋水仙堿組大鼠死亡原因為灌胃時大鼠掙扎導致灌胃針穿破食管和胸腔主動脈致大出血而死亡；模型組死亡大鼠，經解剖及肝臟HE染色檢查證實死于急性肝衰竭。故有3只死亡大鼠不計入統計學分析。

2.2 各組血清ALT、AST、TGF-β1水平

空白對照組大鼠血清ALT、AST水平分別為38.96±3.72和73.34±7.82，模型組大鼠血清ALT、AST水平分別為200.97±10.53和382.65±19.39，與空白對照組相比顯著增加（P＜0.05）。TFL各劑量組和秋水仙堿組血清ALT、AST分別為：高劑量組61.48±8.08、111.29±11.55，中劑量組84.90± 12.83、147.83±12.91，低劑量組94.30±14.33、154.56± 10.36，秋水仙堿組98.65±6.63、154.56±12.68，各治療組血清ALT、AST水平均明顯低于模型組（P＜0.05），且TFL高、中劑量組血清ALT水平較秋水仙堿組明顯降低（P＜0.05）。TFL低劑量組血清ALT水平稍低于秋水仙堿組，但無統計學意義。詳見表1。

空白對照組大鼠血清TGF-β1水平為267.11± 18.78，模型組大鼠血清TGF-β1水平為410.02± 10.75，與空白對照組相比有明顯增高（P＜0.05）。TFL高、中、低劑量組和秋水仙堿組血清TGF-β1水平分別為298.28±17.92、329.17±18.16、354.44± 18.79和364.16±14.88，各治療組均明顯低于模型組（P＜0.05），且TFL高、中劑量組血清AST水平較秋水仙堿組降低（P＜0.05）。TFL低劑量組血清AST與秋水仙堿組無統計學差異。詳見表1。

2.3 肝臟組織病理學變化

Masson染色顯示：①空白對照組：無纖維組織增生（圖1A）；②模型組：匯管區可見大量膠原纖維增生，并在相鄰匯管區、匯管區與中央靜脈之間可見纖維間隔形成，分割、包繞肝小葉（圖1B）；肝纖維化半定量評分較空白對照組明顯增高（P＜0.05），見表3；③TFL高劑量組：可見膠原纖維輕度增生，竇周和小葉內纖維化局限，匯管區及小葉間纖維間隔輕度闊大，肝小葉結構正常（圖1C）；④TFL中、低劑量組和秋水仙堿組匯管區和小葉間纖維粗大，數量較多（圖1D、1E、1F）；⑤TFL高、中、低劑量組和秋水仙堿組肝纖維化半定量評分較模型組低（P＜0.05），TFL高、中劑量組較秋水仙堿組肝纖維化評分低（P＜0.05）。各組肝纖維化半定量計分結果具體見圖1、表2、表3。

表1 大鼠血清ALT、AST、TGF-β1表達情況（）

表1 大鼠血清ALT、AST、TGF-β1表達情況（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型 組比較，#P＜0.05；與秋水仙堿組比較，△P＜0.05。

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圖1 肝組織Masson染色（100×）

2.4 各組α-SMA蛋白表達

免疫組化染色結果顯示：α-SMA陽性表達細胞被染成棕黃色。空白對照組大鼠肝組織中α-SMA僅在匯管區和竇周間質細胞中少量表達。模型組大鼠肝組織中α-SMA廣泛表達于中央靜脈、竇周間隙、匯管區和纖維間隔中，其中匯管區和纖維間隔中表達豐富；顯色指數評分顯著高于空白對照組（P＜0.05）。TFL高、中、低各組和秋水仙堿組α-SMA表達均有所減少（P＜0.05），TFL各組呈現劑量依賴性；與秋水仙堿組比較，TFL高、中劑量組α-SMA表達較低（P＜0.05）；TFL低劑量組α-SMA表達較秋水仙堿稍高，但無統計學意義（見圖2、表2）。

2.5 各組PPARγ、c-Ski蛋白表達

免疫組化染色顯示，在空白對照組中PPARγ、c-Ski廣泛 表達且特點相似，在纖維間隔、肝竇、匯管區和中央靜脈等均可見表達，明顯高于模型組（P＜0.05）；與模型組比較，TFL高、中、低劑量組和秋水仙堿組PPARγ、c-Ski表達明顯增加（P＜0.05），且TFL各組有劑量依賴性；與秋水仙堿組比 較，TFL高、中劑量組PPARγ、c-Ski表達明顯增加（P＜0.05）；TFL低劑量組PPARγ、c-Ski表達較秋水仙堿稍低，差異無統計學意義（見圖3、表3）。

3 討論

肝纖維化的分子生物學機制涉及多種細胞、細胞因子和多條信號通路，且其相互影響交聯成網。其中，HSC的激活、增殖是肝纖維化發生的中心環節[1，4]。當肝臟因理化等因素損害時，HSC由靜息狀態被激活轉化為具有增殖、分泌和收縮等活性的MFB，并在細胞內大量表達α-SMA。目前研究認為，α-SMA是HSC活化的重要標志[1，14]。PPARγ屬于配體依賴的核激素受體超家族，可抑制HSC的活化，延緩肝纖維化的形成，并與多條信號通路交聯介導肝纖維化的轉歸[5]，多種內源或外源性PPARγ配體可明顯抑制HSC纖維生成活性[15， 16]。

活性蛋白c-Ski是Ski原癌基因蛋白家族成員，它不能直接與DNA結合，而是作為轉錄輔助子調控相關信號蛋白的核轉錄。TGF-β/Smads信號通路在肝纖維化啟動、進展乃至肝硬化形成中發揮核心作用，c-Ski是TGF-β/Smad信號通路的阻遏子，它可以通過結合TGF-β I型受體（TβRI），從而干擾smad2、smad3磷酸化、阻止磷酸化smad3與smad4結合形成有活性的smad復合物及募集大量輔抑制子而阻斷TGF-β/smad途徑對靶基因的轉錄調控[17，18]。現有報道PPARγ活化后對c-Ski始發于轉錄水平的上調，并提示c-Ski可能是PPARγ的又一靶基因[7]。田雪等[19]報道PPARγ激動劑吡格列酮可以上調糖尿病大鼠腎組織中c-Ski的表達，抑制TGF-β1的表達。

表2 肝纖維半定量評分和α-SMA顯色指數（）

表2 肝纖維半定量評分和α-SMA顯色指數（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與秋水仙堿組比較，△P＜ 0.05。

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表3 各組大鼠肝組織PPARγ、c-Ski顯色指數（）

表3 各組大鼠肝組織PPARγ、c-Ski顯色指數（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與秋水仙堿組比較，△P＜0.05。

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圖2 大鼠肝組織α-SMA免疫組化染色（400×）

本實驗結果顯示：肝纖維化模型組血清AST、ALT水平、肝纖維化半定量評分顯著高于空白對照組（P＜0.05）；TFL高、中、低各組和秋水仙堿組血清AST、ALT水平、肝纖維化半定 量評分均有所減少（P＜0.05），其中TFL高劑量組、TFL中劑量組均優于秋水仙堿組（P＜0.05），表明TFL有較好的護肝和抗肝纖維化作用，且具有一定劑量依從性。肝纖維化模型組肝組織α-SMA顯色指數、血清TGF-β1水平顯著高于空白對照組（P＜0.05），而PPARγ、c-Ski顯色指數明顯降低（P＜0.05）；TFL高、中、低劑量各組和秋水仙堿組肝組織α-SMA顯色指數、血清TGF-β1水平明顯低于模型組（P＜0.05），而PPARγ、c-Ski顯色指數明顯升高（P＜0.05）。這表明，TFL抗肝纖維化作用機制可能是通過上調PPARγ、c-Ski表達水平，抑制α-SMA、TGF-β1高表達，抑制肝星狀細胞活化，進而抑制肝纖維化的發生和發展。

圖3 大鼠肝組織PPARγ、c-Ski免疫組化染色（400×）

綜上所述，荔枝核總黃酮可以降低實驗肝纖維化大鼠血清ALT、AST水平，具有肝功能保護作用；荔枝核總黃酮能夠明顯改善實驗性肝纖維化大鼠肝纖維化程度，具有良好的抗肝纖維化作用；荔枝核總黃酮抗肝纖維化的作用機制可能是通過上調肝臟中PPARγ、c-Ski的表達，抑制α-SMA、TGF-β1高表達，抑制HSC活化，進而抑制肝纖維化的發生和發展。但是，肝纖維化涉及到的細胞分子生物學機制極其復雜，單獨研究荔枝核總黃酮對某類細胞或某幾個信號分子的干預存在局限。后續研究應從細胞信號通路交聯角度繼續完善荔枝核總黃酮抗肝纖維化的具體機制研究，評估其是否具有成為抗肝纖維化新藥的可能。

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Effect of Total Flavone from Litchi chinensis Sonn. on PPARγ/c-Ski Expression in Liver Fibrosis Rat Model

Kang Yi1, Luo Weisheng2, Huang Hong2, Huang Xuping2, Zhang Yangwu2, Huang Rui2, Tan Quanxiao2
(1. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, China; 2. The First Clinical Medical College of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, China)

This study was aimed to observe the protective and treatment effect of total flavone from Litchi chinensis Sonn. (TFL) on dimethylnitrosamine (DMN) induced hepatic fibrosis in rat’s hepatic tissues. The action mechanism was discussed from the aspect of signaling molecules which included peroxisome proliferatoractivated receptor-γ (PPARγ) and c-Ski on the antifibrotic effect of TFL. A total of 90 male SD rats were randomly divided into the blank control group, model group, TFL (high, medium and low dose) group, and the colchicine positive control group, with 15 rats in each group. No rat model was established in the blank control group. Rats in other groups were intraperitoneally injected with 0.5% DMN (2 mL·kg-1, diluted by normal saline, injected on the first 3 days of each week for 4 weeks) for the establishment of hepatic fibrosis rat model. Meanwhile, intragastric administration of TFL (200 mg·kg-1·d-1, 100 mg·kg-1·d-1, 50 mg·kg-1·d-1) was given to the TFL high, medium and low dose group, respectively. The intragastric administration of colchicines of 0.1 mg·kg-1·d-1was given to the colchicines group. Intragastric administration of the same volume of normal saline was given to the blank control group and the model group, once a day for 6 weeks (Intragastric administration of all medication was prepared into injectable suspension with appropriate amount of normal saline). Rats we re sacrificed at the end of the 6thweek. Vacuum blood collection was given fro m the abdominal aorta for the detection of AST, ALT and TGF-β1 levels. Masson staining was used to observe the degree of hepatic fibrosis in rats. And the degree of hepatic fibrosis was semi-quantitatively scored. The immunohistoche mical method was used to detect the relative expression levels of α-SMA, PPARγ and c-Ski in hepatic tissues from each group. The results sho wed that compared with the blank control group, the AST, ALT and TGF-β1 levels, hepatic fibrosis semi-quantitative score, and the expression level of α-SMA in hepatic tissues of the model group were obviously increased (P ＜0.05). The relative expression levels of PPARγ and c-Ski were obviously decreased (P ＜ 0.05). Compared with the model group, the AST, ALT and TGF-β1 levels, hepatic fibrosis semi-quantitative score, and the expression level of α-SMA in each TFL group were obviously decreased (P ＜ 0.05). The relative expression levels of PPARγ and c-Ski in hepatic tissues were obviously increased (P ＜ 0.05) with certain dose-effect relationship. It was concluded that TFL can effectively decrease the hepatic injury of hepatic fibrosis rats induced by DMN, and improve the degree of hepatic fibrosis. The antifibrotic effect of TFL may be realized through the upregulation of PPARγ/c-Ski expression, downregulation of α-SMA and TGF-β1 expression, and the inhibition of hepatic stellate cell activation.

Hepatic fibrosis, flavone from Litchi chinensis Sonn., α-smooth muscle actin, transforming growth factor β1, peroxisome proliferators-activated receptor gamma, c-Ski

10.11842/wst.2016.01.018

R575

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-06-26

修回日期：2015-10-27

＊ 國家自然科學基金地區科學基金項目（81360530）：TGF-β-Smad-CTGF/PPARγ-c-Ski信號交聯介導肝纖維化及荔枝核總黃酮的效應機制，負責人：羅偉生。

＊＊ 通訊作者：羅偉生，博士生導師，教授，主任醫師，主要研究方向：消化系統疾病的臨床和基礎研究。