HPLC測定FKⅣ號顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的含量＊

孫仙玲，秦建平，王憲平，石 偉，錢 俊，吳 云，王振中，蕭 偉

（1. 南京中醫藥大學藥學院 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

HPLC測定FKⅣ號顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的含量＊

孫仙玲1,3，秦建平2,3，王憲平2,3，石 偉1,3，錢 俊2,3，吳 云2,3，王振中2,3，蕭 偉1, 2, 3＊＊

（1. 南京中醫藥大學藥學院 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：建立同時檢測FKⅣ號顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的HPLC含量測定方法。方法：采用HPLC含量測定法，色譜柱為Kromasil C18 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm)；以乙腈-0.1% 磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，芍藥苷檢測波長為230 nm，綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B檢測波長為306 nm；柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結果：芍藥在7.539-482.470 μg·mL-1范圍內呈良好線性關系（r=1.000），平均回收率為101.10 %；綠原酸在2.003-128.166 μg·mL-1范圍內呈良好線性關系（r=1.000），平均回收率為100.76%；虎杖苷4.503-288.200 μg·mL-1范圍內呈良好線性關系（r=1.000），平均回收率為100.74 %；丹酚酸B在4.621-295.752 μg·mL-1范圍內呈良好線性關系，平均回收率為99.91 %（r=0.999 8）。結論：該方法簡便可靠，重復性好，可作為FKⅣ號顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的含量測定方法。

FKⅣ號顆粒 HPLC 芍藥苷 綠原酸 虎杖苷 丹酚酸B

FKⅣ號顆粒是一種治療盆腔炎性后遺癥的中藥制劑，具有活血化瘀、清利濕熱的作用，用于治療腹痛、腹墜脹、腰酸痛、白帶增多、月經不調、盆腔腫塊等癥狀，其處方由大血藤、赤芍、丹參等10味中藥組成。其中，大血藤等益氣清熱為君藥，虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛為臣藥，赤芍、丹參理氣活血為佐藥。通過查閱文獻結合藥效篩選可知，處方中蒲公英、大血藤、菝葜中均含綠原酸，該成分具有較強的抗菌消炎作用，同時虎杖苷、芍藥苷、丹酚酸B也是本方的主要藥效成分[1-10]。本課題以FKⅣ號顆粒為研究對象，采用HPLC法測定這4種指標性成分的含量，為評價和控制該制劑的質量提供一定的依據。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（Metter Toledo公司）；Centrifuge 5415D高速離心機（德國eppendorf公司）；DAD紫外檢測器（美國Agilent公司）；Mettler AE240電子分析天平（德國梅特勒公司）；芍藥苷對照品（批號：1110736-201337；質量分數以96.4%計）；綠原酸對照品（批號：110735-201314；質量分數以96.6%計）；虎杖苷對照品（批號：111575-200502）；丹酚酸B（批號 :111562-201110）；以上對照品均由中國食品藥品檢定院提供。FKⅣ號顆粒（自制，批號分別為：140801、141112、141113）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；自制純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性試驗

采用Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0-35 min，10%-40%A）；體積流量1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm（芍藥苷），306 nm（綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B）；進樣量10 μL，柱溫30℃，理論塔板數均大于3 000，色譜圖見圖1和2。

圖1 混合對照品溶液（A）和FKⅣ號顆粒（B）的HPLC圖（230 nm）

圖2 混合對照品溶液（C）和FKⅣ號顆粒（D）的HPLC圖（306 nm）

2.2 對照品溶液的制備

分別取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加70%甲醇配成濃度為芍藥苷53.35 μg·mL-1、綠原酸15.63 μg·mL-1、虎杖苷44.92 μg·mL-1、丹酚酸B 36.97 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定重量，超聲提取（250 W，40 kHz）30 min，冷卻至室溫，稱重，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，離心，過0.45 μm有機濾膜，即得。

2.4 陰性供試品制備

處方中芍藥苷來自于赤芍，虎杖苷來自于虎杖，綠原酸來自于大血藤、蒲公英、菝葜等3味藥材，丹酚酸B來自于丹參，按FKⅣ號顆粒的生產工藝分別制備缺赤芍、虎杖、丹參、大血藤、蒲公英、菝葜以及同時缺大血藤、蒲公英、菝葜3味藥材的陰性制劑，并按“2.3”項下方法制備各陰性供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察

取陰性供試品溶液適量，進樣測定，結果表明：虎杖、赤芍、丹參陰性制劑對所測組分無干擾，而大血藤、菝葜、蒲公英中均含有綠原酸。

2.5.2 線性關系考察

分別取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加70%甲醇配制成混合對照品母液（芍藥苷482.47 μg·mL-1、綠原酸124.60 μg·mL-1、虎杖苷288.22 μg·mL-1、丹酚酸B 295.75 μg·mL-1），將其用70%甲醇逐級稀釋得系列混合對照品溶液，分別進樣，測定峰面積。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程，見表1。

圖3 供試品溶液（E）和赤芍陰性（F）的HPLC圖(230 nm)

圖4 供試品溶液（G）和各陰性制劑（H，I，J，K，L，M）的HPLC圖(306 nm)

2.5.3 精密度試驗

取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B的混合對照品溶液，按“2.1”色譜條件連續進樣6 次，結果芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B 峰面積的RSD值分別為1.28%、0.35%、1.17%、1.05%，這表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗

取FKⅣ號顆粒（批號：140801）0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進樣測定，分別計算峰面積的RSD值，結果：芍藥苷0.32%、綠原酸0.70%、虎杖苷0.20%、丹酚酸B 0.89%。這表明在24 h 內樣品溶液在室溫條件下基本穩定。

2.5.5 重復性試驗

精密稱取FKⅣ號顆粒（批號：140801）0.5 g，按“2.3”供試品溶液制備方法平行制備6 份樣品溶液，依照“2.1”項下的色譜條件，進樣測定各成分峰面積，結果：測得芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B的平均含量分別為5.37 mg·g-1、1.61 mg·g-1、3.91 mg·g-1、4.10 mg·g-1；RSD值 分 別 為 0.79%、0.59%、0.64%、1.05% 。

2.4.6 加樣回收試驗

精密稱取FKⅣ號顆粒（批號：140801）0.25 g，置于50 mL容量瓶中，分別加入含芍藥苷1.472 mg·mL-1、綠 原 酸 0.404 mg·mL-1、虎 杖 苷 0.991 mg·mL-1、丹酚酸B 1.113 mg·mL-1的混合對照品溶液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，各平行制備供試品溶液3份。進樣，測定峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分平均回收率與RSD

表3 樣品含量測定結果（n=2）

2.4.7 樣品的測定

取3批FKⅣ號顆粒，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進樣測定，結果見表3。

3 討論

本實驗采用二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）對樣品進行全波段掃描，根據芍藥苷、綠原酸、虎杖苷和丹酚酸B的最大吸收波長及吸收曲線，選擇230 nm測定芍藥苷的含量，306 nm測定綠原酸、虎杖苷和丹酚酸B的含量，并且對4個指標成分進行了峰純度的驗證，實驗結果表明：在本實驗所確定的檢測條件下樣品中所測定的4個成分不含其他干擾成分。

本研究考察了不同濃度乙醇、甲醇兩種溶劑系統對各指標成分提取率的影響；對比了回流、超聲兩種不同的提取方式；對提取溶劑用量和提取時間進行了比較，最終優選出本實驗所采用的供試品制備方法，即50 mL 70%甲醇，超聲提取30 min。

在流動相選擇方面，本研究比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.026%磷酸水溶液4種不同比例流動相體系及等度、梯度條件下對色譜行為的影響，結果顯示：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫分離效果較好[11-15]。并且，本文考察了25、30、35℃3種不同柱溫和0.8、1.0、1.2 mL·min-13種不同流速對各指標成分分離結果的影響，研究表明，在柱溫30℃、流速1.0 mL·min-1的條件下分離效果最佳。

中藥藥效的發揮往往是多種活性成分共同作用的結果[16]。本文采用多指標含量測定的方法同時測定該制劑中的4種有效成分，該思路符合中藥多組分、多靶點的特性。本研究結合所測定成分的最大吸收情況，采用雙波長法進行測定，方法學考察結果表明：本文所建立的方法簡便可行、重復性好、靈敏度高，為FKⅣ號顆粒的質量控制提供了依據。

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Content Determination of Paeoniflorin, Chlorogenic Acid, Polydatin and Salvianolic Acid B in FKⅣ Granules by HPLC

Sun Xianling1,3, Qin Jianping2,3, Wang Xianping2,3, Shi Wei1,3, Qian Jun2,3, Wu Yun2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei1,2,3
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China; 3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study was aimed to establish the simultaneous content determination of paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B in FKⅣ granules by HPLC. The Kromasil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used as chromatographic column. The acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution was used as mobile phase with gradient elution. The detection wavelength of paeoniflorin was 230 nm. And the detection wavelength of chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B was 306 nm. The column temperature was 30℃. The sample injection volume was 10 μL. The results showed that paeoniflorin had a good linear relationship in the range of 7.539-482.470 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 101.10%. Chlorogenic acid showed a good linear relationship in the range of 2.003-128.166 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 100.76%. Polydatin showed a good linear relationship in the range of 4.503-288.200 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 100.74%. Salvianolic acid B showed a good linear relationship in the range of 4.621-295.752 μg·mL-1(r = 0.999 8) with the average recovery rate of 99.91%. It was concluded that the method was simple and reliable with good reproducibility. It can be used as a method for the content determination of paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B in FKⅣ granules.

FKⅣ granules, HPLC, paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin, salvianolic acid B

10.11842/wst.2016.01.021

R284

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2014-12-24

修回日期：2015-03-02

＊ 科學技術部國家重大新藥創制專項（2013ZX09402203）：FKⅣ號顆粒的藥學研究，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士生導師，研究員，主要研究方向：中藥新劑型的研究與開發。