鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片的藥代動力學研究

張婉直，王秀華，惠民權，吉紅梅，竇建衛(1.西安交通大學藥學院，西安　710061；.西安力邦肇新生物科技有限公司，西安　710075)

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·藥劑·

鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片的藥代動力學研究

張婉直1，2，王秀華1，2，惠民權2，吉紅梅2，竇建衛1*(1.西安交通大學藥學院，西安710061；2.西安力邦肇新生物科技有限公司，西安710075)

摘要：目的建立一種測定動物血漿中鹽酸羅匹尼羅的方法，并進行鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片的藥物動力學研究，并計算與參比制劑(Requip XLimg)的相對生物利用度。方法6只Beagle犬分別單次口服鹽酸羅匹尼羅滲透泵片(受試制劑)和Requip XLimg(參比制劑)1片，用LC-MS法測定血漿中的藥物濃度，計算藥物動力學參數和相對生物利用度。結果參比制劑和受試制劑的主要藥代動力學參數tmax分別為(2.92 ± 0.49)和(3.58 ± 0.49)h，Cmax分別為(2.60 ± 0.41)和(2.35 ± 0.39 )ng·mL-1，MRT分別為(7.76 ± 0.89)和(8.48 ± 0.59) h，t1/2(Ke)分別為(4.70 ± 0.67)和(5.94 ± 1.19) h，AUC(0～)分別為(16.06 ± 5.55和(17.90 ± 2.75) ng·mL-1·h，AUC(0～∞)分別為(16.71 ± 5.87 )和(19.03 ± 3.08) ng·mL-1·h，受試制劑相對于參比制劑的相對生物利用度Fr為111.48 %。結論統計結果顯示，各主要藥動學參數均無顯著性差異。本方法能測定口服鹽酸羅匹尼羅滲透泵的血藥濃度，進行動物藥物動力學和相對生物利用度研究。

關鍵詞：鹽酸羅匹尼羅；滲透泵型控釋片；藥代動力學；相對生物利用度；LC-MS

鹽酸羅匹尼羅(ropinirole)是一種選擇性非麥角林多巴胺受體激動劑，能有效地、有選擇性地激動腦內黑質-紋狀體多巴胺D2受體，臨床上用于治療帕金森氏癥和中度、重度多動腿綜合征。鹽酸羅匹尼羅緩釋片(商品名：Requip XL)是由GSK開發的，2008年在美國獲得批準上市，用于治療先天性帕金森病[1]，2014年在CFDA批準GSK的羅匹尼羅緩釋片在中國進口上市。本品口服效果好，絕對生物利用度為45%~

55%，在臨床上為帕金森患者提供了一種安全、有效的治療藥物。本研究建立了一種LC-MS法測定血漿中的藥物濃度的方法，計算藥物動力學參數及與受試制劑的相對生物利用度。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100-6460型高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(安捷倫科技公司)；離心機(上海安亭儀器公司)；分析天平(Sartorius，BP211D 電子天平，德國)；離心濃縮儀(Labconco，美國)；超聲波儀(KS-120D，新芝儀器廠)；旋渦儀(XW-80A，上海精科實業有限公司)。

1.2試藥羅匹尼羅對照品(美國USP，批號F0J036)；鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片(軍事醫學科學院毒物藥物研究所，批號20130417，規格2 mg)；羅匹尼羅緩釋片(骨架型)(葛蘭素史克制藥有限公司，批號1ZP9727，規格2 mg)；苯海拉明對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100066-200807)；甲醇、乙腈(色譜純，J. T. Baker，USA)；其他試劑均為分析純；蒸餾水為自制重蒸餾水。

2實驗方法

2.1血藥質量濃度測定

2.1.1色譜條件色譜柱：艾杰爾Venusil XBP C18柱(50 mm×2.1 mm， 5 μm)；流動相：乙腈∶3 mL·L-1的甲酸溶液=70∶30；流速：0.25 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；內標：苯海拉明。離子極性：正離子；離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化(ESI)；離子檢測方式：多反應監測(MRM)；檢測對象：羅匹尼羅(m/z261→114，裂碎電壓：110 V，碰撞能量：18 eV，加速電壓：4 eV)；苯海拉明(m/z256→167，裂碎電壓：75 V，碰撞能量：19 eV，加速電壓：4 eV)；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣流速：11 L·min-1；霧化室壓力：35 psi；干燥氣溫度：300 ℃。見圖1。

圖1羅匹尼羅和苯海拉明(內標溶液)的質譜圖

a.羅匹尼羅；B.苯海拉明

Fig.1 Mass spectrograms of ropinirole and diphenhydramine(Internal standard solution)

a.ropinirole；B.diphenhydramine

2.1.2色譜行為空白血漿樣品、空白血漿加入對照品和內標溶液及給藥后的動物血漿樣品色譜圖見圖2。由圖2可見，在選定的色譜條件下，血漿中的內源性物質對測定無干擾。

2.1.3血漿的預處理在1.5 mL EP管中加入10 μL內標溶液(40 ng·mL-1的苯海拉明甲醇溶液)，靜置揮干溶劑。精密量取Beagle犬含藥血漿100 μL加入試管中，置于渦旋儀上渦旋30 s。加入二氯甲烷1 mL，渦旋3 min，以13 000 r·min-1離心5 min；取有機層約0.9 mL，置于1.5 mL潔凈EP管中，在離心濃縮儀上30 ℃、28 min揮干溶劑。殘渣用100 μL流動相渦旋1 min溶解，4 ℃下以14 000 r·min-1離心10 min，取上清液進行LC-MS分析。

圖2典型LC-MS圖

a.空白血漿；B.空白血漿+對照品+內標；C.給藥后的動物血漿樣品；1.羅匹尼羅；2.苯海拉明

Fig.2 Typical LC-MS chromatograms

a.blank plasma；B.blank plasma with reference substance and internal standard；C.animal plasma samples after the administration；1. ropinirole；2.diphenhydramine

2.1.4標準曲線的制備及定量下限在1.5 mL EP管中加入10 μL不同質量濃度的羅匹尼羅標準溶液和10 μL內標溶液，靜置揮干溶劑。精密量取Beagle犬血漿100 μL加入試管中，置于渦旋儀上渦旋30 s。其余按照2.1.3項下處理方法操作，制成的血漿藥物質量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 ng·mL-1，結果表明，血漿中羅匹尼羅質量濃度在0.05～10.00 ng·mL-1范圍內，質量濃度與峰面積有良好的線性關系，回歸方程：f=0.720 1C+0.071 59(r=0.997 5)，定量下限為0.05 ng·mL-1。

2.1.5方法學驗證

2.1.5.1血漿樣品的基質效應在1.5 mL EP管中加入10 μL質量濃度分別為1.00，10.00和100.00 ng·mL-1的羅匹尼羅標準溶液和10 μL內標溶液，每組平行5個樣品，靜置揮干溶劑；殘渣用100 μL流動相溶解，配成藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1的標準液。進樣分析，記錄樣品與內標峰面積的比值fs(fs=As/Ai)。另精密量取比格犬血漿100 μL加入EP管中，加入二氯甲烷1 mL，渦旋3 min，以13 000 r·min-1離心5 min；取有機層0.9 mL置于1.5 mL潔凈EP管中，精密加入質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1的羅匹尼羅標準溶液10 μL和內標溶液10 μL，于離心濃縮儀上30 ℃、28 min揮干溶劑。殘渣用100 μL流動相溶解，進樣分析，記錄樣品與內標峰面積的比值fx。

羅匹尼羅的基質效應按下式計算，基質效應(%)=fx/fs×100%，結果見表1。結果說明，該方法在低、中、高濃度的基質效應分別為106.68%，105.88%

和99.99%，血漿的基質效應不影響對藥物和內標的檢測。

表1基質效應測定結果

Tab.1Results of matrix effect

±s)

2.1.5.2精密度在1.5 mL EP管中加入10 μL質量濃度分別為1.0，10.0和100.0 ng·mL-1的羅匹尼羅標準溶液，按照2.1.3項下處理方法操作。血漿藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1，在日內和日間對每種質量濃度平行配制5份樣品。記錄色譜圖，計算羅匹尼羅峰面積As和內標峰面積Ai的比值f。1 d內連續重復5次，為日內精密度；不同日期重復，每天測定1次，共測定3次，為日間精密度，結果詳見表2。

精密度實驗結果表明，各質量濃度水平下，日內及日間精密度符合規定。

表2方法的精密度

Tab.2The precision of the method

±s)

2.1.5.3提取回收率在1.5 mL EP管中加入10 μL不同質量濃度的羅匹尼羅標準溶液和10 μL內標溶液，配成藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1的標準液，靜置揮干溶劑。殘渣用100 μL流動相溶解，進樣分析，記錄樣品與內標峰面積的比值fs(fs=As/Ai)。另取EP管15支，精密加入不同質量濃度的羅匹尼羅標準溶液10 μL，靜置揮干溶劑。精密量取Beagle犬血漿100 μL加入EP管中，置于渦旋儀上渦旋30 s。配制成血漿藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1的含藥血漿。按照2.1.3項下的處理方法操作，記錄樣品與內標峰面積的比值fx。

提取回收率按下式計算，回收率(%)=fx/fs×100%，結果見表3。

表3提取回收率測定結果

Tab.3 Recovery experiment results

±s)

2.1.5.4準確度在1.5 mL EP管中加入10 μL質量濃度分別為1.0，10.0和100.0 ng·mL-1的羅匹尼羅標準溶液和10 μL內標溶液(40 ng·mL-1)，靜置揮干溶劑。精密量取比格犬空白血漿100 μL加入EP管中，置于渦旋儀上渦旋30 s。加入二氯甲烷1 mL，渦旋3 min，以13 000 r·min-1離心5 min；取有機層約0.9 mL，置于1.5 mL潔凈EP管中，置于離心濃縮儀上30 ℃、28 min揮干溶劑。殘渣用100 μL流動相渦旋1 min溶解，在4 ℃下以14 000 r·min-1離心10 min，取上清液至自動進樣器樣品管中，進樣分析。血漿藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1，每一質量濃度平行配制6份，記錄色譜圖，計算羅匹尼羅峰面積As和內標峰面積Ai的比值f。將測得的比值f代入隨行標準曲線，以測得量與加入量之比計算方法準確度，結果見表4。結果表明，在低、中、高質量濃度下該方法的準確度符合要求。

表4準確度測定結果

Tab.4 Results of the accuracy test

±s)

2.1.5.5血漿樣品室溫的穩定性在1.5 mL EP管中精密加入質量濃度分別為1.0，10.0和100.0 ng·mL-1的羅匹尼羅標準溶液10 μL內標溶液，靜置揮干溶劑。精密量取Beagle犬血漿0.1 mL加入試管中，置于渦旋儀上渦旋30 s。配制成血漿藥物質量濃度分別為0.10，1.00和10.00 ng·mL-1的含藥血漿。每一質量濃度平行配制5份，在室溫環境下放置24 h，考察血漿樣品的穩定性，見表5。結果表明，血漿樣品在室溫放置24 h穩定。

表5血漿樣品室溫放置的穩定性

Tab.5 Stability of plasma samples placed at room temperature

±s)

2.2體內藥物動力學研究

2.2.1實驗動物實驗用6只Beagle犬，平均體質量10.0±1.0 kg，雄性(由軍事醫學科學院實驗動物中心提供)。

2.2.2實驗方案6只Beagle犬給藥前禁食12 h；次日清晨分別單次口服受試制劑鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片2 mg(1片)或參比制劑羅匹尼羅緩釋片(骨架型)2 mg(1片)。服藥8 h后喂食。

2.2.3血樣采集分別于給藥前和給藥后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，5，6，8，10，12，16，24和36 h于犬后肢小腿外側靜脈取血2 mL，置于含肝素的離心管中。采集的血樣立即離心分離，以3 500 r·min-1離心8 min；分離上層血漿，血樣放置-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

3結果

6只Beagle犬口服鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片2 mg(1片)或參比制劑羅匹尼羅緩釋片(骨架型)2 mg(1片)的藥-時數據見圖3～4，用3p97藥物動力學計算程序，以AIC最小為原則結合相關系數等指標，計算各藥動學參數和相對生物利用度。見表6～7。

圖36只Beagle犬口服受試制劑(2 mg)的藥-時曲線

Fig.3 Concentration-time curves of oral test preparation (2 mg)in 6 dogs

圖46只Beagle犬口服參比制劑(2 mg)的藥-時曲線

Fig.4 Concentration-time curves of oral reference preparation(2 mg)in 6 dogs

表6Beagle犬口服受試制劑和參比制劑的藥代動力學參數(2 mg)

Tab.6 Pharmacokinetic parameters(2 mg) of oral test preparation and reference preparation

±s)

2種制劑的AUC(0~t)之間無顯著差異，將計算的血藥質量濃度時間曲線下面積AUC(0~t)數據代入Equ.2，計算受試制劑相對于相同劑量的參比制劑的相對生物利用度Fr為111.48%。

表7AUC(0-t)測定結果與相對生物利用度

Tab.7 Results of AUC(0~t)and relative bioavailability

Beagle犬受試制劑AUC(0～t)參比制劑AUC(0～t)Fr/%118．3816．38112．19216．8810．57159．68317．3611．36152．76315．9117．8689．09523．1425．8489．57615．7114．32109．75均值17．9016．06111．48

4討論

本實驗所研究的鹽酸羅匹尼羅滲透泵型控釋片(2 mg)與參比制劑羅匹尼羅緩釋片(2 mg)(Requip XL)相比，2種制劑在Beagle犬體內的tmax、Cmax、MRT以及AUC(0~∞)等藥代動力學參數無顯著差異，相對生物利用度Fr為111.48%。

目前報道的測定動物血漿或組織中羅匹尼羅藥物濃度的方法有：14C放射性同位素標記法[2]、放射性同位素標識的免疫檢定法[3]、高效液相色譜法[4]及高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)聯用[5-7]等。由于前2種方法在實驗室無法實現，而HPLC法要求藥物的質量濃度較大，本研究中2 mg的給藥劑量無法測定，因此，本研究采用LC-MS測定動物血漿中的藥物質量濃度，該方法專屬性強、靈敏度高、準確度高，可滿足動物血漿中藥物質量濃度的檢測。

目前治療帕金森的藥物中，擬多巴胺藥物最常用的是左旋多巴，可與鹽酸羅匹尼羅合用，有文獻報道將其制成微囊[8]或胃漂浮片[9]，可為帕金森患者提供更多的選擇。

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Pharmacokinetic study of controlled release Ropinirole Hydrochloride Osmotic Pump Tablets

ZHANG Wanzhi1，2，WANG Xiuhua1，2，HUI Minquan2，JI Hongmei2，DOU Jianwei1*(1.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；2.Xi′an Libang Zhaoxin Biological Technology Limited Company，Xi′an 710075，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a determination method of ropinirole hydrochloride in animal plasma to evaluate the pharmacokinetics of controlled release Ropinirole Hydrochloride Osmotic Pump Tablets, and to provide the relative bioavailability compared with reference formulation (Requip XLimg) MethodsA single oral dose of controlled release Ropinirole Hydrochloride Osmotic Pump Tablets (test formulation) and Requip XLimg(reference formulation) were administered to six Beagle dogs respectively. The concentration of ropinirole hydrochloride in Beagle dog plasma was analyzed by LC-MS. The pharmacokinetic parameters and relative bioavailability were calculated. ResultsThe main pharmacokinetic parameters of reference formulation and tested formulation were as follows: tmaxwere (2.92±0.49) and (3.58±0.49) h，respectively；Cmaxwere (2.60±0.41) and (2.35±0.39) ng·mL-1，respectively； MRT were (7.76±0.89) and (8.48±0.59) h，respectively； t1/2(Ke) were (4.70±0.67) and (5.94±1.19) h， respectively； AUC(0-) were (16.06±5.55and (17.90±2.75) ng·mL-1·h，respectively； AUC(0-∞)were (16.71±5.87) and (19.03±3.08) ng·mL-1·h，respectively. The relative bioavailability of the test formulation and reference formulation was 111.48%. ConclusionThe results suggested that the main pharmacokinetic parameters have no significant difference. The method established can be used to determine the concentration of ropinirole hydrochloride in plasma and to evaluate the pharmacokinetics and relative bioavailability in animal studies.

Key words:ropinirole hydrochloride；controlled release osmotic pump tablets；pharmacokinetics；relative bioavailability；LC-MS

(收稿日期：2015-08-22)

*通信作者：竇建衛，男，博士，副教授，碩士研究生導師

作者簡介：張婉直，女，在讀碩士研究生，工程師

基金項目：陜西省社會發展科技攻關項目 (編號：2015SF082)

中圖分類號：R945

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0172-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.018