HPLC法測定大鼠血漿中槐定堿

高 華，紀紅燕，鄧　寧，杜　偉，費平霞，孫維紅，黨宏萬，文友民(寧夏醫科大學總醫院藥劑科，銀川750004)

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HPLC法測定大鼠血漿中槐定堿

高 華，紀紅燕，鄧寧，杜偉，費平霞，孫維紅，黨宏萬，文友民*(寧夏醫科大學總醫院藥劑科，銀川750004)

摘要：目的建立HPLC法測定大鼠血漿中槐定堿的體內分析方法，并用于其藥動學研究。方法以苦參堿為內標，血漿樣品在1.0 mol·L-1氫氧化鈉堿性條件下加入1.0 mL三氯甲烷液-液萃取，采用Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)色譜柱分離，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol·L-1KH2PO4，磷酸調pH 3.00)=5∶95，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，在此條件下測定。采用DAS 2.0軟件進行藥動學參數估算。結果槐定堿在0.25～25 μg·mL-1內線性良好(r=0.999 7)，提取回收率為76.6%~90.4%，日內、日間精密度符合要求。槐定堿主要藥動學參數t1/2、AUC、Cmax分別為1.75± 0.66 h、10.80± 2.69 mg·h·L-1和5.56± 0.78 mg·L-1。結論該方法快速、靈敏、 專屬性強，可用于槐定堿藥的代動力學分析。

關鍵詞：槐定堿；高效液相色譜法；藥代動力學

槐定堿(sophoridine)是從寧夏特色藥材苦豆子中分離出的單體生物堿，具有抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、鎮痛、抗病毒和免疫抑制等作用[1-3]。研究發現，

槐定堿對白血病細胞株、表皮癌株有抑制作用，而且抑瘤作用具有較強的選擇性。此外，臨床上也發現槐定堿能夠單獨治療一些惡性腫瘤，如惡性淋巴瘤、消化道腫瘤和惡性滋養細胞腫瘤等，是一種高效低毒的抗癌生物堿[4]，具有重要的臨床開發應用價值。本研究旨在建立簡單、快速的HPLC法，以探討槐定堿在大鼠體內的藥代動力學過程，期望通過本實驗為槐定堿的進一步研究以及臨床應用和后續制劑研發提供方法參考和實驗依據。

1儀器與材料

1.1儀器1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括G1322A型脫氣機，G1311A型泵，G1329A型自動進樣器，G1316A型柱溫箱和G1314B型紫外檢測器；HPD-25無油隔膜真空泵(天津市達因儀器廠)；5804R臺式低溫冷凍離心機(美國eppendorf公司)；SI-0246渦旋混合儀(美國SI公司)；OS-SYS氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2試藥槐定堿(質量分數>99.5%，寧夏紫荊花制藥有限公司，批號 121080)；苦參堿(質量分數為100.0%，中國藥品生物制品檢定所，批號 110805-200508)；甲醇、乙腈為色譜純(Fish Scientific 公司)；KH2PO4、NaOH、CCl4均為分析純；實驗用水為雙蒸水。

1.3動物 健康SD大鼠，雌雄各半，鼠齡11～12周，體質量為300±20 g，購買于寧夏醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(寧)2014-0003。SPF級環境飼養，飼養條件為相對濕度40%～70%，室溫22～28 ℃。預養1周后進行實驗。實驗動物的使用通過了寧夏醫科大學總醫院倫理委員會的論證。

2方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1槐定堿標準溶液的配制 精密稱取10.27 mg槐定堿對照品，置于10 mL量瓶中，用純水溶解，定容至刻度，搖勻，得到1 mg·mL-1的儲備液Ⅰ。以流動相為稀釋溶液，逐步將儲備液Ⅰ稀釋成100 μg·mL-1的儲備液Ⅱ。置于4 ℃冰箱中保存備用。

2.1.2內標溶液苦參堿溶液的配制 稱取1.01 mg苦參堿對照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得到100 μg·mL-1的苦參堿溶液。以甲醇為稀釋液，逐步稀釋得到質量濃度為1.00 μg·mL-1的苦參堿溶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

2.2色譜條件 色譜柱：Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)；保護柱：ZORBAX SB-C18(4 mm×2.0 mm，5 μm)；乙腈-0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液=5∶95(磷酸調節pH至3.0)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.3血漿樣品的預處理精密吸取血漿100 μL，置于2 mL EP管中，精密加入苦參堿溶液(1.0 μg·mL-1)100 μL，渦旋混勻后加入1.0 moL·L-1氫氧化鈉溶液20 μL，渦旋震蕩1 min，加入三氯甲烷1.0 mL，渦旋震蕩1 min，以4 000 r·min-1離心5 min，取下清溶液，55 ℃空氣流，吹干。100 μL流動相將殘渣溶解，渦旋混勻30 s后，以14 000 r·min-1高速離心10 min，取10 μL上清液進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 方法專屬性 取大鼠空白血漿、含槐定堿+內標苦參堿溶液的血漿、大鼠靜脈注射給藥后的血漿樣品，按照2.3項下方法處理，考察血漿中有無干擾物的存在，并考察該方法的專屬性。各組樣品的HPLC色譜圖見圖1。從圖1中可以看出樣品的測定不會受血漿中內源性物質的干擾，在當前色譜條件下，槐定堿和內標苦參堿的峰形良好，保留時間分別為5.5和6.4 min，峰形對稱，專屬性良好。

圖1HPLC圖

a.空白血漿；B. 苦參堿+槐定堿；C.大鼠給藥后的血漿樣品；1.苦參堿；2.槐定堿

Fig.1 HPLCchromatograms

a. blank plasma；B. matrine + sophoridine；C. plasma sample 1. matrine 2. sophoridine

2.4.2 標準曲線及檢測限 取槐定堿對照品溶液以大鼠空白血漿為稀釋溶液，配成質量濃度為0.25，0.5，1.25，2.5，5.0，12.5和25.0 μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，按照2.3項下方法處理，進樣10 μL。以槐定堿與內標物峰面積比(Y)對槐定堿的藥物質量濃度(X)進行線性回歸。槐定堿血漿標準曲線為：Y=0.584 5X- 0.029 1(r=0.999 7，權重系數=1/X)，其線性范圍為0.25~25.0 μg·mL-1，0.25 μg·mL-1為槐定堿的最低檢測質量濃度。

2.4.3 精密度及相對回收率取100 μL大鼠空白血漿，配制成質量濃度為0.5，2.5和20.0μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，每個質量濃度6個樣品，按照2.3項下方法操作，每個濃度樣品測定3 d。計算其日間、日內精密度與相對回收率，結果見表1。

2.4.4絕對回收率 取100 μL大鼠空白血漿，配制成質量濃度為0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，每個濃度6個樣品，按照2.3項下方法操作，另用流動相配制相同濃度的槐定堿對照品，各6份，按照2.2項下操作，取10 μL進樣分析，以血漿樣品測定的峰面積與同質量濃度的對照溶液峰面積的比值，計算絕對回收率，結果見表1。

表1槐定堿的日內、日間精密度與回收率

Tab.1 Intra-day and inter-day precision and recovery of sophoridine

(n=6)

2.4.5穩定性采用大鼠空白血漿配制質量濃度為0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定堿標準血漿樣品，各6份，按照2.3項下方法操作，考察血漿樣品室溫放置4 和12 h，置于-70 ℃保存12 d以及樣品經歷3次凍融后的穩定性。結果表明，在不同的存放條件下，RSD值均小于15.0%。

2.5 槐定堿大鼠體內藥動學考察 SD大鼠，雌雄各半，禁食12 h，自由飲水。取5只大鼠尾靜脈注射給予槐定堿溶液10 mg·kg-1，在給藥后0.08，0.17，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0 h分別從大鼠眼眶后靜脈叢取血500 μL，置于含肝素的離心管中，以14 000 r·min-1離心10 min，取200 μL，按照2.3項下方法操作并測定其血藥質量濃度，繪制血藥質量濃度-時間曲線，結果見圖2。采用DAS 2.0軟件對所有數據進行處理并計算其藥代動力學參數，結果見表2。

圖2 槐定堿平均血藥質量濃度-時間曲線

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of sophoridine

表2槐定堿的主要藥動學參數

Tab.2 The main pharmacokinetics pharameters of sophoridine

參數x±sAUC(0～t)/mg·h·L-110．80±2．69AUC(0～∞)/mg·h·L-112．80±2．77MRT(0～t)/h1．62±0．43MRT(0～∞)/h1．56±0．71t1/2z/h1．75±0．66tmax/h1．97±0．63CLz/L·h-1·mg-10．81±0．19Cmax/mg·L-15．56±0．78

3 討論

本實驗以大鼠作為研究對象，采用HPLC法建立測定大鼠體內槐定堿血藥濃度的方法。大鼠尾靜脈注射給予槐定堿后，血藥濃度下降很快，隨后下降速度變慢，體內過程符合二室模型，動力學行為符合線性動力學過程[5]。實驗結果與王羚酈等[6]在小鼠體內藥物代謝動力學研究的結果相符合。

在血漿樣品的預處理中，弱堿性藥物在堿性條件下，采用有機溶劑進行提取，可以使血漿樣品中的內源性雜質較少，干擾小。故本實驗在堿性條件下，選用氯仿溶液進行液-液萃取，其提取回收率較高,符合實驗的測定需要。該測定方法取樣量少、操作簡單、專屬性強，能夠滿足槐定堿藥動學研究的要求。

參考文獻：

[1]楊巧麗，顧政，黃華.中藥苦豆子的研究進展[J].西北藥學雜志，2011，26(3): 232-234.

[2]李凱，王銀蘭，朱會琴. HPLC法測定苦豆子總堿中3種生物堿的含量[J].西北藥學雜志，2004，19(2):53-54.

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[5]吳永江，陳建軍，程翼宇. 液-質聯用研究槐定堿、槐果堿和苦參堿在兔體內的藥代動力學[J].分析化學，2005，33(11):1627-1630.

[6]王羚酈，王素軍，曾潔，等. 槐定堿在小鼠體內藥物代謝動力學的研究[J].中南藥學，2014，12(5):442-444.

Determination of the concentration of sophoridinein rat plasma by HPLC

GAO Hua，JI Hongyan，DENG Ning，DU Wei，FEI Pingxia，SUN Weihong，DANG Hongwan，WEN Youmin*(Department of Pharmacy，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of sophoridinein rat plasma by HPLC and to study its characteristics of pharmacokinetics. Method Sophoridine and internal standard matrine were extracted from rat plasma with liquid-liquid extraction，then were separated on a Synergi 4 μ Hydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm) column with a mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer(pH 3.00) (5∶95) at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm，and the column temperature was 30 ℃. The pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 2.0 practical pharmacokinetics program. Results The assay was linear in the range of 0.25～25 μg·mL-1( r=0. 999 7) with recoveries ranged from76.6% to 90.4% and satisfied inter- and intra- day precision. The parameters of t1/2，AUC，Cmaxfor sophoridine were 1.75±0.66 h，10.80±2.69 mg·h·L-1and 5.56±0.78 mg·L-1，respectively. Conclusion The developed method was specific, rapid and sensitive, and can be used for the determination of sophoridine inpharmacokinetic study.

Key words:sophoridine；HPLC；pharmacokinetics

(收稿日期：2015-07-02)

*通信作者：文友民，男，主任藥師

作者簡介：高華，男，主管藥師，碩士研究生

基金項目：寧夏醫科大學青年基金項目(編號：XQ2012012)

中圖分類號：945

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0183-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.021