D-乳酸產生菌的研究進展

劉 娟， 王 剛*， 張明磊， 姜興林， 郭明珠， 陳 光

(1.吉林農業大學 生命科學學院,吉林 長春 130118；2.長春職業技術學院 信息分院，吉林 長春 130118)

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D-乳酸產生菌的研究進展

劉 娟1， 王 剛1*， 張明磊1， 姜興林1， 郭明珠2， 陳 光1

(1.吉林農業大學 生命科學學院,吉林 長春 130118；2.長春職業技術學院 信息分院，吉林 長春 130118)

D-乳酸作為一種重要的工業有機酸，是許多手性物質的中間體，特別是高光學純度D-乳酸因其可以提高聚乳酸材料的性能而廣泛應用。微生物發酵法是目前D-乳酸的主要生產方法，而菌種在發酵生產中占有非常重要的地位，是決定整個生產過程的關鍵。就近幾十年來產D-乳酸常用菌株、菌種進化、研究方法、存在問題及前景做一綜述。

D-乳酸; 乳酸菌; 乳酸脫氫酶

乳酸又名α-羥基丙酸、2-羥基丙酸、丙醇酸，分為L-乳酸、D-乳酸，在食品、農業、環保、醫藥、飼料、日用品、化工等領域具有廣泛的用途。近年來，D-乳酸作為許多手性物質的中間體被廣泛應用，特別是高光學純度的D-乳酸，因其可以提高聚乳酸材料的性能而得到越來越多的關注。D-乳酸的合成方法可以分為化學合成法、酶法和發酵法。化學合成法合成效率高，但成本高且毒性大，不適合廣泛和可持續生產；酶法可以得到單一旋光乳酸但工藝復雜，成本較高，尚未大規模應用于工業；發酵法生產條件溫和，對環境污染小，幾乎無毒副作用，是合成D-乳酸的理想方法。我國的D-乳酸生產量遠遠不能滿足工業的需要，生產技術相對落后，尤其是對D-乳酸生產菌研究相對落后，因此，高光學純度D-乳酸生產菌株的選育及開發是非常重要的。D-乳酸的發酵菌種種類繁多，其中以芽胞乳桿菌、乳桿菌和基因工程大腸埃希菌為主，本文就D-乳酸發酵細菌菌種近幾十年的研究進展進行回顧分析，并展望了菌種選育的發展方向。

1 芽胞乳桿菌

芽胞乳桿菌是兼性厭氧菌，通過同型發酵葡萄糖、果糖和甘露糖等產D-乳酸，在產D-乳酸方面應用廣泛。丁子建等[1]在國內首次提出利用發酵法生產D-乳酸，研究了溫度、含氧量、pH、碳氮源、維生素和金屬離子等對芽胞乳桿菌產D-乳酸的影響，D-乳酸光學純度為96.04%，產量為40.7 g/L。Zhao等[2]應用菊糖芽胞乳桿菌 Y2-8在纖維素固定床生物反應器中以玉米粉水解液進行發酵生產D-乳酸，分批發酵產率可達1.62 g/(L·h)，高于游離細胞發酵，D-乳酸光學純度在99%以上。Nguyen等[3]開展了乳桿菌、棒桿菌以鮮薯同步糖化發酵生產D-乳酸和L-乳酸的研究。

1.1 芽胞乳桿菌的物理、化學誘變育種

微生物菌種的物理、化學誘變應用范圍廣，操作方法簡單，但突變范圍大、不定向，需從大量的突變體中篩選出目的菌株，工作量較大。Zheng等[4]利用原生質體融合技術提高菊糖芽胞乳桿菌ATCC 15538的D-乳酸產量，對起始菌株進行紫外誘變、硫酸二乙酯誘變和pH梯度篩選，經過3輪的基因組重排得到重組菌株F3-4，其在5 L發酵罐中D-乳酸產量達到93.4 g/L，比起始菌株增加了39.8%。于培星等[5-6]以凝結芽胞桿菌JD-063D為出發菌株，利用紫外線、鈷60γ-射線輻照、硫酸二乙酯、微波進行復合誘變，使凝結芽胞桿菌產酸量由61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由97.5%增加到98.7%以上。李銀鏑[7]利用濃度為0.015%的溴甲酚紫作為篩選劑，以菊糖芽胞乳桿菌SP-BME 126為出發菌株，經過3輪紫外誘變，篩選出D-乳酸高產菌株SP-MD1，與出發菌株相比D-乳酸的產量提高了7.1%，而且穩定性良好。劉聯杰等[8]對菊糖芽胞乳桿菌DO進行20 s的紫外及硫酸二乙酯(DES)誘變，得到突變株的D-乳酸產量為61.35 g/L，比出發菌株的42.57 g/L提高了44.1%，而且遺傳性狀穩定。鄭璐等[9]以芽胞乳桿菌Y2-8為出發菌株，采用常壓室溫等離子體(ARTP)技術對其進行誘變,誘變過程中采用高純氦氣作為工作氣體，通氣量10 L/min，功率100 W，照射距離2 mm，菌液10 μL。誘變后利用高糖-溴甲酚綠高通量篩選平板復篩，最終篩選得到1株遺傳穩定性良好而且產酸速率高的突變菌株Y90s-1，D-乳酸發酵速率達1.05 g/(L·h)，比出發菌株提高了36.3%。

1.2 芽胞乳桿菌的基因工程育種

近幾年利用分子手段改造菌株迅速發展，其定向性強，可大量擴增出目的產物的基因，定向改造菌株。胡媛等[10-11]以枯草芽胞桿菌基因組DNA為模板，擴增出葡萄糖脫氫酶基因(gdh)，與表達載體pETduet-1連接得到pETduet-GDH。再以粘質沙雷氏菌基因組DNA為模板，擴增出乳酸脫氫酶基因(ldh)，與已構建的pETduet-GDH連接獲得pETduet-LG，轉化進入E.coliBL21進行共表達。重組大腸埃希菌可以還原丙酮酸生成D-乳酸。底物轉化率達到86.5%，D-乳酸產量為17.3 g/L。鄭輝杰[12]以菊糖芽胞乳桿菌SP-BME126 為出發菌株，通過紫外、硫酸二乙酯(DES)誘變和 pH 梯度篩選3種方法，篩選出遺傳穩定性較好的菌株。再利用響應面實驗得到原生質體的優化條件，在 RSM 優化工藝條件下得到原生質體，原生質體通過3輪基因重排、pH優化、單因素實驗、PB實驗和中心組合實驗對菌種的發酵條件進行優化，最終菌株最大D-乳酸產量達到91.7 g/L。

2 大腸埃希菌

大腸埃希菌是生物領域最常使用的工程菌株之一，是模式菌株，其基因序列研究得比較清楚，基因組序列已全部測出。在生物基因工程領域常被應用于基因的克隆和載體的構建。孟武等[13]克隆大腸埃希菌E.coliW3110菌株中的4個代謝木糖的關鍵基因：木酮糖激酶基因(xylB)、木糖異構酶基因(xylA)、轉醛醇酶基因(talA)和轉酮醇酶基因(tktA)，并構建了含有低氧啟動子相關基因Pvgb 的木糖加強型表達載體，將其轉化到甲酸乙醇基因缺失突變株大腸埃希菌 W3110中。在 W3110 中構建了組成型代謝木糖基因的表達載體，使受體菌獲得了利用木糖高效產生 D-乳酸的能力，E.coliW3110突變株中的質粒得到表達，加強重組菌株代謝木糖能力，重組菌株代謝木糖合成 D-乳酸的光學純度達到 99%以上，產量比出發菌株提高了近 10%。周麗等[14]刪除了大腸埃希菌菌株B0013-030 的琥珀酸 (frdA) 和乙酸 (tdcDE)合成途徑，并構建了含有突變盒的重組質粒，再將突變盒整合于目的基因上并去除抗性基因，D-乳酸產量達114.5 g/L，光學純度大于 99.9%。進一步刪除了tdcD 和tdcE基因，得到111.9 g/L的D-乳酸產量，乙酸和琥珀酸的合成量降低，其他副產物含量較低。李劍等[15]利用乳酸脫氫酶和丙酮酸裂解酶缺陷的大腸埃希菌作為宿主，互補篩選獲得新型的乳酸脫氫酶基因(ldh)，并通過基因序列分析獲得2個保守區域，其中V147～D176區是NADH的結合位點，R77～E107區是酶的活性部位。田甜等[16]以可利用蔗糖的大腸埃希菌HBUT-D1為出發菌株，采用λRed 重組系統技術將大腸埃希菌利用蔗糖的阻遏基因(cscR)敲除，得到1株可降解并促進蔗糖運輸的大腸埃希菌工程菌株E.coliHBUT-D2。并對 HBUT-D2 進行厭氧生長馴化，得到1株在厭氧及相同發酵條件下生長良好的菌株HBUT-D。并且進行了發酵條件優化，最終得到了D-乳酸，產量為 62 g/L，光學純度為99.9%，HBUT-D比出發菌株產酸量提高了38%。

3 乳桿菌

乳桿菌為革蘭陽性菌，不產芽胞，多數為益生菌，分解糖的主要產物是乳酸。在自然界中廣泛存在。

3.1 乳桿菌的物理、化學誘變育種

Nakano等[17]研究了利用碎米同步發酵產D-乳酸，結果表明乳桿菌發酵過程中，中和劑氫氧化鈣可顯著提高產酸量。Joshi[18]對乳桿菌(Lactobacilluslactis) NCIM 2368 進行反復的紫外誘變，獲得1株能利用纖維素酶水解纖維素材料得到纖維二糖的突變株，乳酸最高產量達到 110 g/L。Demirci 等[19]對D-乳酸產生菌德氏乳桿菌ATCC 9649 進行反復化學誘變EMS誘變，得到生長速率快、滯后期短、乳酸產量高和乳酸耐受性較強的突變株DP3，其最高產酸量達到77 g/L，比原始菌株提高了32.76%。Kadam等對德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii) NCIM 2365 進行馴化和紫外誘變處理，得到1株生長速率較快、滯后期短的誘變突變株 UC-3，在150 g/L蔗糖的條件下，D-乳酸產量最高達135 g/L[16]。

3.2 乳桿菌的基因工程育種

利用分子手段改造乳桿菌是很理想的方法，將乳桿菌的產酸基因轉入到其他菌株中，重組菌株便有了兩親本綜合的優良性狀，得到了研究者所需要的目的菌株，分子手段是改造菌種最有效的方法之一。黃艷燕等[20]將鼠李糖乳桿菌基因組DNA中的D-(+)-乳酸脫氫酶基因ldhD連接到載體pSE380上，將構建的表達質粒轉化進入大腸埃希菌，重組菌株經IPTG誘導表達并在大腸埃希菌中檢測到D-(+)-乳酸脫氫酶的酶活。

4 其他菌株

其他類型的重組菌株和突變株在D-乳酸的發酵生產中也占有舉足輕重的地位，例如粘質沙雷氏菌和酵母菌在基因工程構建D-乳酸高產菌株的研究中，得到了廣泛的應用。滿永博[21-22]將構建的乳酸脫氫酶質粒pPbud-dldh轉入粘質沙雷氏菌，構建得到重組菌株S.MR1-dldh，與出發菌株相比較，葡萄糖的消耗速率加快而且D-乳酸的產量提高到(64.8±1.96) g/L。蘇剛等[23-24]對經過基因工程改造的粘質沙雷氏菌R1發酵生產D-乳酸進行了培養基的優化，確定了菌種的培養條件，在含有50 g/L的乳酸鹽培養基中篩選對乳酸鹽耐受性好的菌株，從而得到乳酸耐受性好的D-乳酸生產菌株，D-乳酸的產量達83.5 g/L。Ishida 等[25]通過敲除酵母菌丙酮酸脫羧酶基因(pdc1)，再將明串珠菌亞種2個拷貝的D-乳酸脫氫酶基因轉入到酵母菌中，該菌株可發酵生產 61.5 g/L 的 D-乳酸，光學純度達 99.9%以上。Okino等[26]利用基因工程手段構建了產 D-乳酸的谷氨酸棒桿菌。先敲除谷氨酸棒桿菌L-乳酸脫氫酶基因(L-ldh)，再將大腸埃希菌D-乳酸脫氫酶基因轉入，該菌株能利用缺氧的礦物鹽培養基，發酵生產D-乳酸的量達到120 g/L，光學純度高于 99.9%。

5 展 望

菌種性能優劣直接關系到發酵工業的成敗，一般情況下，野生型菌株往往無法達到工業要求，必須對其進行育種才能實現。傳統微生物菌種選育多采用物理或化學誘變劑(紫外線、X 射線、γ 射線、快中子以及各種化學誘變劑)對出發菌株進行誘變，從而獲得生產能力提高的突變菌株。隨著D-乳酸在工業領域應用范圍日益擴大，日益短缺的D-乳酸生產菌種問題逐漸成為限制其工業化的瓶頸。目前，D-乳酸生產菌的改造多采用傳統微生物菌種選育方法，部分學者應用基因工程育種方法。然而，微生物是一個復雜的有機體，目的產物的合成需要整個代謝網絡的多步酶促反應進行協同作用。僅進行單一酶促反應的基因工程改造對提高菌株的發酵性能作用極其有限。因此，充分利用現有各種D-乳酸產生菌基因組序列信息數據，分別在基因組水平、轉錄組水平、蛋白質組水平、代謝產物組水平以及代謝通量組水平開展D-乳酸生產菌的代謝網絡分析和育種，是D-乳酸生產菌的主要方向。

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The Research Progress of D-Lactic Acid Fermentation Bacterial Strains

LIU Juan1, WANG Gang1, ZHANG Ming-lei1, JIANG Xing-lin1, GUO Ming-zhu2, CHEN Guang1

(1.Schl.ofLifeSci.,JilinAgric.Uni.,Changchun130118; 2.Coll.ofInformt’n,ChangchunVocat’lInst.ofTechnol.,Changchun130118)

As an important industrial organic acid, D-lactic acid is the intermediate of many chiral substances. It has received increased attention for use as a monomer for the production of biodegradable poly especially. Microbial fermentation is the most important method for D-lactic acid production and microorganisms play a key role in the fermentation method. The research development of D-lactic acid-producing microorganisms was summarized.

d-lactic acid; lactic acid bacteria; lactate dehydrogenase

科技部農業科技成果轉化項目(2013GB2B100110)；長春市科技支撐項目(12XN18)；吉林省教育廳項目(2014[465])；

劉娟 女，碩士研究生。研究方向為微生物學。Tel：0431-84532886，E-mail：1040746303@qq.com

* 通訊作者。男，博士，副教授，碩士生導師。研究方向為生物催化與代謝工程。Tel：0431-84532886，E-mail：gangziccc@163.com

2015-02-21；

2015-03-16

Q939.97

A

1005-7021(2016)01-0096-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.016

吉林省秸稈綜合利用技術創新平臺項目(吉高平臺字[2014]C-1)