苦蕎多糖抗氧化及對Hep G2細胞增殖抑制作用

李姍姍，崔曉東，李晨，李玉英，王轉花（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

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苦蕎多糖抗氧化及對Hep G2細胞增殖抑制作用

李姍姍，崔曉東，李晨，李玉英，王轉花*
（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

摘要：采用熱提取和Superdex G75分子排阻層析對苦蕎多糖進行了提取及初步的分離純化，通過紫外光譜掃描和聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定多糖的純度；純化的苦蕎多糖在體外檢測其抗氧化能力及對Hep G2細胞增殖抑制作用。結果表明，制備的多糖純度較高，不含核酸和蛋白質。用純化的苦蕎多糖在體外檢測其抗氧化能力及其對Hep G2細胞增殖和細胞核的影響。結果表明，該多糖對羥基自由基有明顯的清除作用，清除作用與濃度有一定的量效關系，EC50為0.17mg/mL，對Hep G2細胞增殖有明顯的抑制作用，并可使細胞核形態出現聚縮，染色質DNA出現斷裂。苦蕎多糖的制備及其體外抑制腫瘤細胞的增殖等初步研究為深入考察其生物學活性奠定了基礎。

關鍵詞：苦蕎；多糖；抗腫瘤；羥自由基

多糖（polysaccharide）是由多個單糖分子縮合經糖苷鍵連接而成的一類分子結構復雜且分子量龐大的聚糖類物質。多糖及其復合物在高等動植物的細胞膜和微生物細胞壁中含量非常豐富，對維持生命活動起著至關重要的作用。近年來，由于天然多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、調節免疫等多種生物活性，毒副作用小等優點，對天然多糖的研究及開發呈現逐漸增多的趨勢[1]。近期研究表明，多種不同來源的多糖具有明顯的抗腫瘤效應。蘆薈多糖能激活巨噬細胞，增加一氧化氮合酶mRNA的表達進而增加NO的合成，刺激巨噬細胞表面分子的表達，發揮其抗腫瘤的活性[2]。枸杞多糖可提高H22荷瘤小鼠的T淋巴細胞轉化能力和人體自然殺傷細胞（NK細胞）活性，同時顯著提高SOD含量降低MDA含量，表明枸杞多糖的抗腫瘤機制可能與其增強機體免疫力和提高機體的抗氧化活性有關[3]。銀耳中的酸性多糖能提高機體免疫力，且具有抗腫瘤作用[4]。此外，鐵筷子，南瓜，銀杏等其它的植物多糖也具有明顯的抗腫瘤效應[5-6]。

蕎麥為蓼科蕎麥屬植物，營養及藥用價值較高，是一種古老的藥食同源性植物[7]。蕎麥，尤其苦蕎麥，含有豐富的黃酮類物質，具有抗氧化、降血糖，降血脂、防止DNA損傷等多種生理功能[8]，對糖尿病、高血脂、冠心病、中風等病癥有一定的預防作用，逐漸引起人們的關注。作為蕎麥中主要功能物質的多糖能顯著地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，但是蕎麥多糖抑制腫瘤增殖的報道較少，僅見于臺灣學者報道蕎麥多糖可通過誘導人THP-1白血病細胞分化從而抑制其增殖[9]。

為了拓寬藥食同源作物-蕎麥的基礎和應用研究范圍，揭示蕎麥多糖在抗病、抗衰老及其抑制腫瘤細胞的增殖等方面的作用，本試驗以山西黑苦蕎為原料，采用熱提取和Superdex G 75分子排阻層析對苦蕎多糖進行了提取及初步分離純化，并采用分子排阻層析對獲得的粗品進行純化，初步研究了苦蕎麥多糖在體外對·OH自由基的清除作用及抗腫瘤效應，為蕎麥功能性保健食品的開發研究提供一定依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

山西黑苦蕎：山西省農業科學院農作物品種資源研究所提供；人肝癌細胞株Hep G2：中國科學院細胞資源中心；胰蛋白酶（trypsin）、二甲基亞砜（DMSO）：Solarbio公司；DMEM培養基：美國Hyclone；胎牛血清：杭州四季青公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

CO2細胞培養箱：美國Thermo公司；AKTA explorer蛋白純化系統：美國GE公司；FV1000激光共聚焦顯微鏡：日本OLYMPUS公司；酶聯免疫檢測儀：美國BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1苦蕎多糖的提取和純化

將苦蕎種子粉碎，去殼，過40目篩，得到苦蕎粉。經丙酮浸泡、脫脂，除去色素、小分子糖等物質，殘渣晾干備用。稱取20 g脫脂苦蕎粉，加入500 mL去離子水，90℃提取4 h，離心取上清。將沉淀再次加入去離子水，重復上述提取步驟。合并兩次提取的上清液，對上清進行減壓濃縮至體積約100 mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃過夜沉淀。離心取沉淀，用少量水溶解。將溶解的沉淀用Sevag法除蛋白[10]，重復3次，冷凍干燥后得到苦蕎粗多糖。準確稱取1 mg多糖粗品，加入1 mL去離子水，充分溶解后取0.5 mL上樣到Superdex G 75 HR 10/300凝膠柱，以10 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，控制流速為0.5 mL/min，280 nm波長下檢測多糖樣品中蛋白的含量。同時將樣品收集到不同的EP管中，每管收集1 mL，用苯酚硫酸法測定多糖的含量，跟蹤多糖含量的變化。

1.3.2多糖的純度測定

取適量凝膠層析后的苦蕎多糖溶液采用紫外掃描法在200 nm~500 nm波長下進行紫外光譜掃描，檢測其在260 nm及280 nm處的吸收情況，從而判定多糖的純度。同時采用SDS-PAGE法檢測蛋白質的殘留量。以標準分子質量蛋白為對照，在4 %濃縮膠和12.5 %分離膠中電泳，考馬斯亮藍R-250染色。

1.3.3苦蕎多糖對羥自由基（·OH）的清除作用

采用水楊酸氧化法[11]，分別加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇和不同濃度的待測液各1 mL，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37℃水浴反應0.5 h后，分別測定對照組和樣品組在510 nm處的吸光度。按以下公式計算清除率。

式中：E為清除率，%；A0為對照組光吸收值；AX為樣品組光吸收值；AX0為空白組光吸收值。

1.3.4苦蕎多糖對Hep G2細胞增殖的影響

人肝癌細胞株Hep G2，在DMEM完全培養基（10 %胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），37℃，5 % CO2培養箱中培養。生長對數期Hep G2細胞經胰蛋白酶消化，接種于96孔細胞培養板中，繼續過夜培養。次日分別加入不同濃度（25、50、100、200 μg/mL）苦蕎多糖，每組各設置5個復孔，以加培養基的實驗組作空白對照，分別培養24 h和48 h后，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，棄去孔中培養液及MTT，每孔加入150 μL DMSO，室溫低速振蕩10 min。待結晶物完全溶解后，在酶標免疫測定儀（BIO-RAD MODEL 550）測定490 nm處的吸光值。

1.3.5苦蕎多糖對Hep G2細胞細胞核的影響

將無菌的蓋玻片鋪于6孔板底部，取對數期的細胞適量接種于6孔細胞培養板中，在CO2培養箱中培養，過夜至細胞貼壁，用200 μg/mL的苦蕎多糖，分別作用Hep G2細胞24 h和48 h，DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察Hep G2細胞核形態的變化。將同樣條件作用后的Hep G2細胞提取DNA[12]，2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化。

2結果與分析

2.1苦蕎多糖的分離純化

按照1.3.1方法，以1∶25（g/mL）的料液比，在溫度為90℃，提取4 h后，通過Sevag法除去游離蛋白質，獲得多糖粗提物。苦蕎多糖的純化及鑒定如圖1所示。

A.苦蕎粗多糖在Superdex G 75凝膠柱的分離；B.多糖的純度鑒定；Mr.標準分子量蛋白；1.純化的苦蕎麥多糖。圖1苦蕎多糖的純化及鑒定Fig.1 Purification and identification of TBL

粗多糖經Superdex G75凝膠層析進行了初步的分離純化，苯酚-硫酸法測定的結果顯示（圖1A），在洗脫體積為8 mL~15 mL時，為多糖的吸收峰。根據多糖出峰位置判定，該提取物分子量約為20 kD~50 kD，因此我們推測獲得的蕎麥多糖可能為一種復合多糖。紫外掃描法結果顯示，制備的多糖在280 nm處沒有明顯的吸收，同時SDS-PAGE試驗結果（圖1B）也表明，制備的多糖不含蛋白，純度較高。

2.2苦蕎多糖對羥基自由基的清除作用

羥自由基是體內最活躍的活性氧，可導致大量疾病的發生，對羥自由基清除率的檢測是抗氧化劑抗氧化活性檢測的指標之一。按照1.3.3方法測定并計算純化的苦蕎多糖對羥自由基的清除作用，結果如圖2所示。

圖2多糖對羥自由基（·OH）的清除作用Fig.2 Scavenging effects of polysaccharides on hydroxyl free radical

由圖2可知，在較低濃度時（0.1mg/mL~0.3mg/mL），苦蕎多糖對羥自由基的清除作用隨著濃度升高而增強，有明顯的量-效關系，但當濃度達到0.3 mg/mL或更高時，清除能力增加緩慢，經計算可知，清除率達50 %時，所需多糖濃度EC50為0.17 mg/mL。試驗中，以清除羥自由基能力較強的VC做參照，圖2顯示VC的EC50為0.03mg/mL，對羥自由基的清除率可達近100 %，苦蕎多糖最大清除率為72 %左右，表明本法提取的多糖具有一定的抗氧化能力。

2.3苦蕎多糖對Hep G2細胞增殖的影響

采用MTT法測定了苦蕎多糖對HepG2細胞增殖的影響。苦蕎多糖HepG2細胞增殖抑制作用如圖3所示。

圖3苦蕎多糖對Hep G2細胞增殖抑制作用Fig.3 The effect of tartary buckwheat polysaccharides on Hep G2 cells proliferation

對從曲線圖（圖3）分析，苦蕎多糖對Hep G2細胞的抑制作用呈劑量與時間依賴性。當不同濃度多糖（50 μg/mL~200 μg/mL）作用時間為24 h時，隨著苦蕎多糖濃度的升高，對Hep G2細胞增殖抑制作用也逐漸升高。而同樣濃度的多糖作用48 h時的抑制效果明顯強于24 h。當濃度為200 μg/mL，作用48 h后，苦蕎多糖對Hep G2細胞增殖最大抑制率可達35 %。

2.4苦蕎多糖對Hep G2細胞核的影響

苦蕎多糖對Hep G2細胞核和DNA的影響見圖4和圖5。

A.對照組；B. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細胞24 h；C. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細胞48 h。圖4苦蕎多糖對Hep G2細胞細胞核的影響Fig.4 Hep G2 Cells nuclei morphological changes induced by tartary buckwheat polysaccharides

A.對照組；B. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細胞24 h；C. 200 g/mL苦蕎多糖作用Hep G2細胞48 h。圖5苦蕎多糖對Hep G2細胞DNA的影響Fig.5 The effect of Tartary buckwheat polysaccharides on DNA of Hep G2 cells

苦蕎多糖作用Hep G2細胞24 h和48 h后，經DAPI染色，圖4顯示，細胞核都出現了不同程度的濃縮及典型細胞凋亡的特征，且作用48 h時，核異化率明顯高于24 h。另外，用苦蕎多糖作用Hep G2細胞不同時間后，檢測DNA的變化，圖5顯示，苦蕎多糖可使染色質DNA出現斷裂，產生大小不等的DNA片段，但未出現典型的200整數倍的DNA ladder條帶。有關苦蕎多糖抑制Hep G2細胞增殖的機理還有待深入研究。

3討論與結論

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的一類結構復雜的大分子物質，分子中的單糖又可以在不同的位點相互連接形成不同的支鏈或者直鏈結構。與其它天然產物類似，目前很難得到純多糖或分子量不變的多糖，同時多糖的純度和分子量和藥效有很大關系[13]。不同的提取條件，如溫度、pH值的改變可能會破壞植物多糖的高級結構，引起多糖鏈降解，從而導致植物多糖某種活性的失活。因此研究蕎麥多糖的提取條件與相應生物活性的關系有利于多糖在食品、醫療和保健領域的應用。

多糖的抗腫瘤作用機制可以歸納為兩大類：第一類多糖與機體的免疫細胞通過分子間的接觸，激活免疫細胞，釋放出某種信號分子，進而激發和增強免疫反應，間接抑制或殺死腫瘤細胞。例如，從植物、細菌和真菌中提取到β-葡聚糖，使免疫細胞（巨噬細胞、T 和B淋巴細胞及其它效應細胞）迅速處于激活狀態，誘導并調節免疫反應，抑制腫瘤或癌細胞的生長繁殖[14]。另一類多糖是具有細胞毒性的多糖，可以直接殺死腫瘤細胞，如青錢柳多糖可以顯著抑制人宮頸癌Hela細胞的生長，誘使細胞發生凋亡，使細胞在S期發生阻滯[15]。在我們的實驗中發現，苦蕎多糖可以使Hep G2細胞的細胞核形態出現明顯的染色質凝集等凋亡特征，并且出現明顯的DNA斷裂等現象，與Wu等[9]報道存在較大的差異，分析原因可能是二者多糖來源及種類不同，前者來源于普通蕎麥，后者來源于苦蕎麥。同時二者在提取方法上也存在較大的差異，這也可能是二者多糖出現功能差異的原因之一。這些基礎研究也將為深入研究天然生物活性物質的功能，為功能保健食產品的開發利用奠定基礎。

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Antioxidant Activity and Anti-cancer Efficacy on Hep G2 Cells of Polysaccharide from Tartary Buckwheat Seeds

LI Shan-shan，CUI Xiao-dong，LI Chen，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
（Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，Shanxi，China）

Abstract：Tartary buckwheat polysaccharides were isolated by heat extraction and molecular exclusion chromatography，and purity was carried out by UV-visible absorption spectra and SDS-PAGE. The antioxidant activity was evaluated by·OH free scavenging assay. At the same time，anti-cancer efficacy of tartary buckwheat polysaccharides was evaluated. The results showed that the purified polysaccharides contained neither protein nor nucleic acids and had obvious hydroxyl free radical scavenging effect，with an EC50of 0.17 mg/mL. Tartary buckwheat polysaccharides could significantly inhibit the Hep G2 cells proliferation. Moreover，the DNA break of Hep G2 cells occurred after treated with tartary buckwheat polysaccharides. The preparation and the function study of buckwheat polysaccharide have paved the way for the comprehensive research of its biological activity.

Key words：tartary buckwheat；polysaccharide；antitumour；hydroxyl radicals

收稿日期：2014-07-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.003

*通信作者：王轉花（1956—），女，教授，博導，研究方向：蛋白質與生物活性物質。

作者簡介：李姍姍（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：蛋白質與生物活性物質。

基金項目：國家自然/青年科學基金項目（31171659/31300653）；山西省科技項目（2014091028）