羅紅霉素對不同生長期小麥土壤氮形態和脲酶活性的影響

余彬彬，程立娟，王斐，周啟星,*

1. 揚州大學環境科學與工程學院，揚州 225127 2. 浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室，臺州 318000 3. 南開大學環境科學與工程學院，環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300100

羅紅霉素對不同生長期小麥土壤氮形態和脲酶活性的影響

余彬彬1,2，程立娟3，王斐3，周啟星3,*

1. 揚州大學環境科學與工程學院，揚州 225127 2. 浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室，臺州 318000 3. 南開大學環境科學與工程學院，環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300100

抗生素類藥物作為添加劑被用于養殖業中，大部分以原形或其代謝產物形式進入土壤環境，對土壤環境造成生態危害。通過盆栽實驗，研究了不同濃度羅紅霉素(ROX)對小麥各生長期根際土壤微生物生物量氮、脲酶和無機氮的影響。結果表明，添加ROX后土壤微生物生物量氮在小麥苗期、拔節期和抽穗期受到顯著抑制，而在灌漿期和收獲期，土壤微生物生物量氮卻顯著增長；與對照相比，低濃度(0.2和0.5 mg·kg-1)和中濃度(1.0和2.0 mg·kg-1)ROX脅迫顯著抑制小麥生長苗期、灌漿期和收獲期的根際土壤脲酶活性，而在拔節期和抽穗期，卻顯著誘導脲酶活性；但高濃度(10.0 mg·kg-1)ROX脅迫卻顯著抑制小麥生長期內脲酶活性。低、中濃度ROX脅迫顯著誘導小麥生長期中根際土壤中銨態氮濃度增長，而高濃度組ROX脅迫顯著抑制土壤中銨態氮濃度。ROX脅迫抑制硝態氮，顯示出ROX會影響土壤氮循環。

羅紅霉素；小麥；土壤微生物生物量氮；脲酶；土壤無機氮

長期以來，抗生素被大量用于人和動物的疾病治療中，尤其以亞治療劑量長期添加于動物飼料中來預防動物疾病和促進動物生長。中國每年大約有千萬噸的抗生素和化工合成的抗生素類藥物作為添加劑被用于養殖業中，大部分以原形或其代謝產物形式隨動物糞便排出[1]。自從1970年后，抗生素及其代謝產物在各種環境介質如飲用水[2]、地表水[3]、土壤[4-5]、沉積物[6]、污水處理廠進出水[7]、污泥[8-9]等中都有檢出。抗生素在環境中比較穩定，容易在土壤(或沉積物)中蓄積，所以土壤(或沉積物)被認為是抗生素及其代謝產物的最終歸宿地。抗生素被土壤吸附后降解比較緩慢，很容易在土壤環境中積累，并對生態系統和人體健康構成威脅[10]。2013年，我國抗生素的總使用量為16.2萬噸，其中大環內酯類抗生素的使用量為4.22萬噸，占總使用量的26%[11]。大環內酯類抗生素的大量使用導致了其在污水處理廠出水、江河等地表水環境、甚至飲用水源地中頻繁檢出[12-13]。

我國是小麥生產和消費大國，在小麥播種前后常施用禽畜糞便等有機肥，導致抗生素長期反復進入農田，對農田土壤環境造成生態危害。土壤微生物作為土壤有機質的降解者和植物營養物質的活性庫，在土壤營養物質循環中發揮著重要的作用，同時，它還能代表參與調控土壤中能量流動、養分循環以及有機質轉化等相應微生物的數量，是比較敏感的生物學指標[17]；而土壤脲酶將尿素水解成二氧化碳和氨，在所有參與土壤N循環的酶中，其作用最為突出[18]。土壤微生物生物量、脲酶對植物的生長具有重要的意義，也是表征土壤質量狀況的敏感指標。羅紅霉素(roxithromycin, ROX)是大環類酯類中常見的抗生素，在廢水[14]、地表水[15-16]和沉積物[15-16]中均有檢出。ROX在廣州珠江河底沉積物中達0.105 mg·kg-1[15]，天津陳臺子河底沉積物達0.299 mg·kg-1[16]，其在環境介質中檢出頻繁，生態風險大。因此，本研究以典型大環內酯類羅紅霉素為目標污染物，采用室內培養方法，研究其對土壤微生物生物量氮、脲酶和土壤無機氮的影響，為農田土壤氮循環提供基礎數據，也為抗生素的生態毒性評估提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試冬小麥為(Triticum aestivum L.，購于天津市農業科學院)，ROX購于Sigma公司(純度≥90%)，供試土壤取自天津市薊縣(39°56′07 N, 117°22′37 E)農田表層土(0～10 cm)。土壤采集后風干，去除石塊、植物根莖后，過4 mm篩，備用。其理化性質：pH 7.2，有機質64.77 g·kg-1，總氮1.48 g·kg-1，總磷濃度是1.48%。

1.2 實驗設計

根據ROX的環境濃度(0～0.2 mg·kg-1)，設置盆栽實驗濃度為0、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0 mg·kg-1。羅紅霉素溶解在少量乙醇中，按照設定好的濃度染毒，并充分攪拌使羅紅霉素均勻地分布在土壤中。土壤保持30%～40%的持水量，蓋上防水材料，在室外放置3周，使ROX在土壤中吸附達到自然平衡。3周后，土壤再次混勻裝盆，進行盆栽實驗。

小麥種子先在3%的H2O2中進行表面滅菌，再在2.8 mmol·L-1Ca(NO3)2溶液中浸泡4 h，之后放于鋪有濕濾紙的培養皿中于22～27 ℃培養箱中發芽，直至種子長出胚芽，挑選長勢一致的小麥播種于盆中。每盆(20 cm × 15 cm，1.5 kg)播種小麥種子50粒，放置于溫室中培養，白天27 ℃下光照14 h，夜間22 ℃光照10 h。每天澆水，保持土壤含水率在30%，每個染毒濃度設置3盆平行樣，不定期更換盆的位置。空白對照組(CK)用未進行染毒的空白清潔土壤種植。

小麥根際土壤分別在小麥苗期、拔節期、抽穗期、灌漿期和收獲期取樣，進行土壤微生物生物量氮、脲酶和土壤無機氮的測定。

1.3 測試方法

土壤微生物微生物量氮測定采用氯仿熏蒸-K2SO4方法[19]，土壤脲酶的測定采用靛酚藍比色法[20]，土壤銨態氮和硝態氮在經2 mol·L-1KCl浸提后，采用分光光度法測定[21]。羅紅霉素對小麥生長期內土壤性狀的影響強度通過抑制率反映，計算公式如下：抑制率(%) = [(B-A)/A]×100%，式中：A為CK組別中土壤性狀的特征平均值，B為ROX脅迫下土壤性狀的特征平均值。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 18.0進行統計分析；各處理組的顯著性差異采用單因子LSD進行多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 羅紅霉素對土壤微生物生物量氮的影響

微生物生物量氮可以反映微生物的活性及微生物利用氮源的能力。本研究中，在ROX脅迫下，土壤微生物生物量氮為26.90～50.52 mg·kg-1。由圖1(A)可知，在小麥生長期內，ROX脅迫導致根際土壤微生物生物量發生顯著變化，在拔節期和抽穗期較高，而隨著小麥的生長，土壤微生物生物量氮在灌漿期和收獲期逐漸下降。在小麥生長期，與CK相比，ROX脅迫導致土壤微生物生物量氮發生顯著變化。在ROX脅迫下，土壤微生物生物量氮在小麥苗期、拔節期和抽穗期都受到抑制，約為12.20%～40.00%，而在灌漿期和收獲期，土壤微生物生物量氮卻顯著增長，提升12.19%～41.66%(圖1(B))。在小麥生長期內，與CK相比，不同ROX處理組中根際土壤微生物生物量氮均有所增長，增長率約為10.16%～48.56%。

2.2 羅紅霉素對土壤脲酶的影響

根據圖2(A)可知，在ROX脅迫下，土壤中的脲酶活性在小麥不同生長期發生顯著變化，拔節期和抽穗期較高，隨著小麥的生長，土壤脲酶在灌漿期和收獲期迅速下降。根據圖2(B)可知，與CK相比，低濃度(0.2和0.5 mg·kg-1)和中濃度組(1.0和2.0 mg·kg-1)ROX脅迫下小麥生長的苗期、灌漿期和收獲期土壤脲酶的活性均受到顯著抑制，抑制率為0.68%～20.68%；而在拔節期和抽穗期，低濃度和中濃度組的ROX脅迫顯著誘導土壤酶活性，使其酶活性提高了3.10%～18.20%；但是高濃度(10.0 mg·kg-1)ROX脅迫卻顯著抑制小麥生長期內土壤脲酶活性，使其降低了13.11%～34.74%。在小麥苗期到灌漿期內，與CK相比，不同ROX處理組中的土壤脲酶增長約為0.35%～93.15%，而在收獲期內下降，土壤脲酶下降范圍為6.39%～15.64%。

2.3 羅紅霉素對土壤銨態氮和硝態氮的影響

在ROX脅迫下，土壤中的銨態氮和硝態氮濃度發生變化。根據圖3(A)可知，銨態氮含量為13.14～23.89 mg·kg-1，低濃度和中濃度ROX脅迫顯著誘導土壤銨態氮含量在苗期、拔節期、抽穗期和灌漿期升高，而在收獲期顯著下降。與CK相比，低濃度(0.2和0.5 mg·kg-1)和中濃度組(1.0和2.0 mg·kg-1)ROX顯著脅迫小麥各生長期(苗期、拔節期、抽穗期、灌漿期和收獲期)中土壤中銨態氮濃度增長，增長率為0.56%～41.30%；然而高濃度組(10.0 mg·kg-1)ROX脅迫顯著抑制土壤中銨態氮濃度，抑制率為1.89%～12.23%，在苗期受到抑制最小，拔節期抑制最大(圖3(B))。在小麥生長過程中，與CK相比，不同ROX處理組中土壤銨態氮濃度均有所增長，增長率約為5.77% ～59.61%。

根據圖4(A)可知，ROX脅迫導致土壤硝態氮的濃度不斷下降，含量為6.01～7.98 mg·kg-1。在小麥苗期，與CK相比，低濃度和中濃度ROX脅迫導致硝態氮濃度顯著下降，而高濃度ROX脅迫對土壤硝態氮的抑制不明顯。ROX脅迫導致土壤硝態氮濃度受到的抑制率為1.31%～24.63%(圖4(B))。在小麥生長過程中，與CK相比，高濃度(10.0 mg·kg-1)ROX處理組中土壤硝態氮的濃度降低，降低約2.11%～6.68%。

3 討論(Discussion)

微生物生物量的大小可以表明微生物新陳代謝活動的強弱。在土壤生態系統中，微生物生物量作為有機質降解和轉化的動力，對植物養分轉化、有機碳代謝和污染物的降解具有十分重要的作用[22]。當土壤受到外源污染物污染時，土壤微生物生物量能夠對污染脅迫作出較土壤總氮更敏感的響應。本研究中，在ROX脅迫下，土壤微生物生物量氮在拔節期和抽穗期較高，而在灌漿期和收獲期逐漸下降。在小麥不同生長期內，與CK相比，在ROX脅迫下，土壤微生物生物量氮在小麥苗期、拔節期和抽穗期都受到抑制，而在灌漿期和收獲期卻顯著提高，這與土霉素(0～100 mg·kg-1)對潮土土壤微生物生物量氮呈現抑制—激活—恢復的研究結果不一致[23]，也與王艷等[24]研究磺胺嘧啶(20 mg·kg-1)對土壤微生物生物量氮呈現誘導—抑制的結果不一致，其結果顯示在早期(0～7 d)增加，而在后期(8～35 d)逐漸降低。本研究中不同ROX處理組中根際土壤微生物生物量氮均有所增長，這與劉愛菊等[25]研究發現的土壤微生物生物量氮的含量隨著磺胺甲基嘧啶處理濃度(5～100 mg·kg-1)的增加而逐漸減少的結果不一致，這可能與土壤類型、種植的作物(小麥)和抗生素種類(ROX)的性質有關。隨著小麥生長，小麥根系分泌了一些有機酸，而外加的ROX是有機物，能夠使土壤微生物生物量明顯增加，影響土壤銨態氮、硝態氮和亞硝態氮的水平[26]。

圖1 羅紅霉素(ROX)脅迫對土壤微生物生物量氮的影響注：ROX-0.2、ROX-0.5、ROX-1.0、ROX-2.0、ROX-10.0分別表示ROX的處理濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、10.0 mg·kg-1；不同大寫字母代表同一處理下小麥不同生長期間差異顯著，P<0.05；不同的小寫字母代表同一生長期內處理組間差異顯著，P<0.05。下同。Fig. 1 Effects of on soil microbial biomass nitrogenNote:ROX-0.2, ROX-0.5, ROX-1.0, ROX-2.0, ROX-10.0 stand for ROX treatment group with the ROX concentration of 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0 mg·kg-1; different capital letters represented significant difference between different wheat growth stages,P<0.05; different lowercase letters represented significant difference between different treatments, P<0.05. The same below.

圖2 ROX脅迫對土壤脲酶的影響Fig. 2 Effects of ROX stress on soil urease

土壤脲酶對土壤中氮素的轉化起著重要作用，可以加速土壤中潛在養分的有效化[27]。土壤脲酶活性與土壤氮素營養有直接的關系，有研究認為，土壤脲酶活性在小麥生育期中，從拔節期到灌漿期逐漸升高，在灌漿期達到最高，從拔節到開花為小麥生殖生長期，吸收氮最多，脲酶活性迅速提高[28]。本研究中，ROX脅迫下，土壤脲酶活性在拔節期和抽穗期達到最高，在灌漿期和收獲期逐漸下降，說明ROX脅迫改變了土壤氮素轉化和供氮能力。土壤脲酶活性越高表明土壤氮素轉化能力越強，越有利于作物吸收氮素[29]，在小麥不同生長期內，低濃度(0.2和0.5 mg·kg-1)和中濃度組(1.0和2.0 mg·kg-1)ROX脅迫導致土壤酶活性在小麥生長的苗期、灌漿期和收獲期均受到抑制，然而在拔節期和抽穗期，低濃度和中濃度組的ROX脅迫誘導土壤酶活性提高，這可能是因為低、中濃度ROX以碳、氮的形式進入土壤給部分微生物提供碳、氮源，刺激了部分優勢微生物的生長，導致脲酶活性增強，隨著小麥的生長，在灌漿期和收獲期，部分微生物的生長受到抑制，土壤酶活性降低。而高濃度(10.0 mg·kg-1)ROX脅迫在小麥生長期內卻一直抑制土壤脲酶活性，抑制率為13.11%～34.74%，這與劉愛菊等[25]發現磺胺甲基嘧啶(5～100 mg·kg-1)對土壤脲酶活性呈現明顯的抑制作用的研究結果一致，可能是因為高濃度ROX抑制小麥根系分泌物的數量或者土壤中某些微生物的生長，從而抑制了土壤酶活性。

在北方干旱、半干旱地區，土壤中銨態氮的含量相對穩定，但是作物吸收氮主要以硝態氮形式進行，硝態氮含量隨作物生長季節的變化而變化[30]。與CK相比，低、中濃度ROX脅迫顯著促進了小麥各生長期(苗期、拔節期、抽穗期、灌漿期和收獲期)中根際土壤中銨態氮濃度的增長，而高濃度組(10.0 mg·kg-1)ROX脅迫顯著抑制土壤中銨態氮濃度。這說明低、中濃度的ROX刺激了土壤中某些微生物的生長，加快了氮轉化使得土壤中銨態氮的濃度增加，然而在高濃度時，抑制其增長，減少了硝化作用的底物濃度，從而抑制氮循環。土壤中硝態氮的含量主要影響因素是銨態氮(主要來源為肥料)、pH、礦化速率、土壤類型、土壤肥力和土壤微生物等。在ROX脅迫下，土壤中硝態氮的濃度卻在不斷下降，這與國彬等[31]發現磺胺類抗生素(磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲噁唑)對土壤硝態氮有抑制作用的研究結果一致。這意味著ROX的添加，促使土壤中的氨化速率增加，但卻抑制了硝化效率和礦化速率，使得硝態氮濃度顯著下降。其他研究結果發現，在森林土壤中施加銨肥，增加的銨態氮為土壤硝化作用提供了更多的N源，可能導致土壤中氨氣揮發和土壤中硝態氮、亞硝態氮淋失，從而使得土壤中硝態氮含量減少，說明施肥導致硝化作用降低[32]，本研究中，ROX脅迫嚴重影響土壤硝態氮的變化(濃度范圍為5.87～7.98 mg·kg-1)，這與作者前期研究[33]結果一致，ROX脅迫導致土壤中硝化細菌群落多樣性發生變化，氨氧化細菌菌群數量受到抑制，而亞硝酸鹽氧化細菌菌群數量在低濃度(0.2和0.5 mg·kg-1)受到抑制，在中濃度(1.0和2.0 mg·kg-1)和高濃度(10.0 mg·kg-1)呈現誘導效應，數量顯著增加，導致土壤硝化性能嚴重受損，影響小麥對土壤氮素的吸收，從而影響土壤氮循環。

圖3 ROX脅迫對土壤銨態氮的影響Fig. 3 Effects of ROX stress on soil ammonium nitrogen

圖4 ROX脅迫對土壤硝態氮的影響Fig. 4 Effects of ROX stress on soil nitrate nitrogen

綜上所述，ROX脅迫對拔節期和抽穗期小麥根際土中土壤微生物生物量氮、脲酶活性和銨態氮都有顯著增加效應，這與小麥生殖生長期需要大量的氮素有關，ROX(0.2～2.0 mg·kg-1)脅迫也能促進某些敏感的微生物的生長，增加尿素水解并釋放一定濃度的氨；然而在灌漿期和收獲期，小麥根際土中土壤微生物生物量氮變化不明顯，脲酶活性顯著下降，但是銨態氮濃度持續上升，導致銨態氮濃度變化的原因可能是ROX在小麥生長后期有所降解，因為ROX在水體中的半衰期是130 d或者180 d[34-35]，土壤中ROX的降解產物可能促進了某些微生物的生長，使得土壤中銨態氮濃度升高。本研究沒有考慮土壤全氮含量變化，同時，沒有考慮到土壤反硝化作用、硝酸鹽異化還原成銨等影響因素，抗生素ROX脅迫如何影響土壤氮循環還需開展進一步的工作，但是本研究發現較低濃度的ROX脅迫(0.2 mg·kg-1)也會對土壤微生物生物量氮、脲酶和無機氮造成影響。因此，長期存在的低濃度抗生素會破壞土壤氮循環。

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Effect of Roxithromycin (ROX) on Soil Nitrogen Speciation and Soil Urease in the Different Growth Stage of Wheat

Yu Binbin1,2, Cheng Lijuan3, Wang Fei3, Zhou Qixing3,*

1. School of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation, Taizhou 318000, China 3. Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300100, China

Received 22 June 2016 accepted 25 July 2016

Antibiotics were used as additive medicines in aquaculture, and most of their prototypes or metabolites were discharged into the soil and cause environmental hazard. This manuscript shows the impact of different concentrations of roxithromycin (ROX) on soil microbial biomass nitrogen, urease enzyme, and inorganic nitrogen in rhizosphere soil in various growing periods of wheat using pot experiment. Results showed that soil microbial biomass nitrogen was significantly inhibited by ROX in seedling stage, jointing stage and heading stage, while it was significantly increased by ROX in filling period and harvest stage. Compared with control (CK), the soil urease activities were significantly inhibited in seedling stage, filling stage and harvest stage of wheat, and were significantly induced in jointing stage and heading stage of wheat by low concentration (0.2 or 0.5 mg·kg-1) and medium concentration (1.0 or 2.0 mg·kg-1) groups of ROX. However the soil urease activities were significantly inhibited by high concentration (10.0 mg·kg-1) of ROX in all wheat growth periods. Edaphic ammonium nitrogen was significantly induced by low and medium concentration of ROX in all wheat growing periods, while it was significantly inhibited by high stress of ROX. The suppressing of nitrate nitrogen by ROX indicates that the soil nitrogen cycle in the agricultural ecosystem could be influenced by different concentrations of ROX.

roxithromycin; wheat; soil microbial biomass nitrogen; soil urease; soil inorganic nitrogen

國家自然科學基金項目(31500425)；江蘇省自然科學基金青年科技人才項目(BK20150452)；浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室開放課題(EEC2014-02)

余彬彬(1979-)，女，講師，研究方向為微生物生態學，E-mail: bbyu@yzu.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhouqx@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160622001

2016-06-22 錄用日期：2016-07-25

1673-5897(2016)6-134-10

X171.5

A

周啟星(1953—)，男，土壤學博士，教授，主要研究方向陸生生態毒理與土壤環境基準。

余彬彬, 程立娟, 王斐, 等. 羅紅霉素對不同生長期小麥土壤氮形態和脲酶活性的影響[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 134-143

Yu B B, Cheng L J, Wang F, et al. Effect of roxithromycin (ROX) on soil nitrogen speciation and soil urease in the different growth stage of wheat [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 134-143 (in Chinese)